HPLC 同时分析芎菊上清丸中7个化学成分的含量研究

孙承浩，王吉华

（1.辽阳市中心医院，辽宁辽阳111000；2.辽阳市食品药品检验所，辽宁辽阳111000）

HPLC 同时分析芎菊上清丸中7个化学成分的含量研究

孙承浩1，王吉华2

（1.辽阳市中心医院，辽宁辽阳111000；2.辽阳市食品药品检验所，辽宁辽阳111000）

目的建立HPLC同时测定芎菊上清丸中7个活性成分(栀子苷、连翘酯苷A、绿原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸药根碱、黄芩苷、盐酸小檗碱）含量的方法。方法采用PorosheLL 120 SB-C18(100mm×3.0mm，2.7μm）色谱柱，柱温30℃，以乙腈为流动相A，0.1%磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长为230 nm 0～4.5min(测定栀子苷），348 nm 4.5～9.0 min(测定连翘酯苷A、绿原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸），278 nm 9.0～15.0min(测定盐酸药根碱、黄芩苷、盐酸小檗碱）。结果栀子苷、连翘酯苷A、绿原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸药根碱、黄芩苷、盐酸小檗碱的线性范围分别为4.024～80.48μg/mL(r= 0.9991），2.042～40.84μg/mL(r=0.9993），3.956～79.12μg/mL(r=0.9996），6.090～121.80μg/mL(r=0.9990），4.026～80.52μg/ mL(r=0.9995），3.924～78.48μg/mL(r=0.9998），6.030～120.6μg/mL(r=0.9998）。平均加样回收率(n=6）分别为96.5%，97.5%，95.9%，98.6%，99.8%，98.4%和97.3%；RSD分别为1.5%，1.3%，1.2%，1.4%，1.2%，1.1%和0.9%。结论该方法操作简单，重复性好，为评价和监控芎菊上清丸的质量提供了可靠的方法。

芎菊上清丸；HPLC；含量测定

芎菊上清丸收载于《中国药典》（2010版）一部，由川芎、菊花、黄芩、连翘、黄连等15味中药材组成，具有清热解表、散风止痛之功效，用于外感风邪引起的恶风身热、偏正头痛、鼻流清涕、牙疼喉痛［1］，含量测定项为薄层色谱扫描法测定黄连中盐酸小檗碱的含量。药典规定的含量测定方法基本上是在开放体系中进行，因此影响定量结果的因素较复杂，准确性差。另据现有文献报道［2-5］，可见对芎菊上清丸中黄芩苷、绿原酸进行含量测定的研究，未见同时测定处方中多组分含量的研究报道。为了更好的评价和监督芎菊上清丸的质量，本文采用RP-HPLC梯度洗脱法在同一色谱条件下变换检测波长同时分析处方中5味药材的7个特征性成分的含量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Agilent 1260高效液相色谱仪系统，由G1311A四元泵、G1314B可变波长检测器（VWD）、G1322A在线脱气机组成。

对照品栀子苷（批号为110749-201316）、连翘酯苷A（批号为111810-201103）、绿原酸（批号为110753-201314）、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸（批号为111782-201204）、黄芩苷（批号为110715-201117）、盐酸药根碱（批号为110733-201108）、盐酸小檗碱（批号为110713-201212）均购自中国食品药品检定研究院。供试品芎菊上清丸为北京同仁堂制药有限公司提供，批号为2083068，2083079，3082187。

甲醇、乙腈均为色谱纯，水为重蒸水，其他所用试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制备：混合对照品储备溶液：取栀子苷、连翘酯苷A、绿原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸药根碱、黄芩苷、盐酸小檗碱等对照品适量，加甲醇制成每1mL分别含上述相应物质0.2012 mg、0.1021 mg、0.1978 mg、0.3045 mg、0.2013 mg、0.1962mg、0.3015mg的混合对照品储备溶液。

混合对照品溶液：精密移取混合对照品储备溶液5.0mL于50mL容量瓶中，用60%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，制得混合对照品溶液。

供试品溶液：取芎菊上清丸10丸，称定重量，剪碎，混匀，研细，取3.0g，精密称定，精密加入60%甲醇水溶液50mL，称定重量，超声处理（250 w，50 kHz）30min，放冷，称重，用60%甲醇水溶液补足减失的重量，离心，取上清液，即得。

阴性样品溶液：按芎菊上清丸的处方比例和工艺方法分别制备不含栀子、连翘、菊花、黄芩和黄连的5种阴性样品，并按“1.2.1”项下供试品溶液方法制备阴性溶液。

1.2.2 色谱条件及系统适用性试验：色谱柱：安捷伦Poroshell 120 SB-C18（100mm×3.0 mm，2.7μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，8%A；5～10 min，8%A→20%A；10～15min，20%A→40%A）；流速：1.0mL/ min；检测波长：230 nm 0～4.5 min（测定栀子苷），348 nm 4.5～9.0min（测定连翘酯苷A、绿原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸），278 nm 9.0～15.0min（测定盐酸药根碱、黄芩苷、盐酸小檗碱）；进样量：5μL。理论板数按盐酸小檗碱计算应不低于5000，各峰的分离度均大于1.5。

1.2.3 重复性试验：取同一批号芎菊上清丸样品（批号2083068），称定重量，研细，取约3.0g，共6份，精密称定，分别按“1.2.1”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件分别进样5μL。

1.2.4 回收率试验：取已知含量的芎菊上清丸样品（栀子苷、连翘酯苷A、绿原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸药根碱、黄芩苷、盐酸小檗碱的含量分别为1.485，0.784，1.012，1.544，1.069，3.969，1.221mg/g）粉末6份，每份1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入新配置的混合对照品溶液（各对照品浓度为：栀子苷0.2024 mg/mL、连翘酯苷A 0.1154 mg/mL、绿原酸0.1520mg/mL、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸0.2187mg/mL、盐酸药根碱0.1616mg/mL、黄芩苷0.6033 mg/mL、盐酸小檗碱0.1979 mg/mL）10mL，再精密加入60%甲醇水溶液40mL，按“1.2.1”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件分别进样5μL，计算回收率。

2 结果

2.1 含量测定方法学验证结果

2.1.1 干扰性试验：在上述色谱条件下，供试品中其他成分对栀子苷、连翘酯苷A、绿原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸药根碱、黄芩苷、盐酸小檗碱的测定无干扰（见图1）。

图1 HPLC色谱图A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.栀子阴性溶液；D.连翘阴性溶液；E.菊花阴性溶液；F.黄芩阴性溶液；G.黄连阴性溶液吸收峰：1.栀子苷；2.连翘酯苷A；3.绿原酸；4.3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸；5.盐酸药根碱；6.黄芩苷；7.盐酸小檗碱Fig.1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substances solution；B.sample solution；C-Fructus Gardeniae nagtive solvent；D.Forsythiae Fructus nagtive solvent；E.Flos Chrysanthemi nagtive solvent；F.Radix Scutellariae nagtive solvent；G.Rhizoma Coptidis nagtive solvent；1.Jasminoidin；2.Forsythoside A；3.Caffeotannic acid；4.3，5-Di-O-caffeoylquinic acid；5.Jatrorrhizine hydrochloride；6.Baicalin；7.Berberine hydrochloride

2.1.2 线性关系考察：分别精密移取混合对照品储备溶液1.0，2.0，5.0，10.0，15.0，20.0mL于50mL容量瓶中，用60%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，制得混合对照品系列浓度溶液，依次精密吸取上述混合对照品系列浓度溶液按“1.2.2”项下色谱条件进样测定。以样品浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，栀子苷、连翘酯苷A、绿原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸药根碱、黄芩苷、盐酸小檗碱的线性关系详见表1。

表1 7个成分的线性关系Tab.1 Reasults of linear equations of 7 components

2.1.3 精密度试验：精密吸取同一混合对照品溶液5μL，连续进样6次，结果栀子苷、连翘酯苷A、绿原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸药根碱、黄芩苷、盐酸小檗碱峰面积的RSD分别为0.6%，0.5%，1.0%，0.4%，0.7%，0.4%，0.6%。表明仪器精密度良好。

2.1.4 稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液，在0，2，4，8，12，24 h分别进样5μL，结果栀子苷、连翘酯苷A、绿原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸药根碱、黄芩苷、盐酸小檗碱峰面积的RSD分别为0.8%，1.2%，1.8%，1.6%，0.6%，0.7%，0.5%。表明供试品溶液中的7个待测成分在室温放置24 h内基本稳定。

2.1.5 重复性试验：样品中的栀子苷、连翘酯苷A、绿原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸药根碱、黄芩苷、盐酸小檗碱含量平均值分别为1.485，0.784，1.012，1.544，1.069，3.969，1.221 mg/g；RSD分别为1.5%，0.9%，0.9%，1.2%，1.1%，1.3%，1.0%，表明其重复性良好。

2.1.6 回收率试验结果栀子苷、连翘酯苷A、绿原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸药根碱、黄芩苷、盐酸小檗碱的平均回收率（n=6）分别为96.5%，97.5%，95.9%，98.6%，99.8%，98.4%和97.3%；RSD分别为1.5%，1.3%，1.2%，1.4%，1.2%，1.1%和0.9%。

2.2 样品测定 取3种批号的芎菊上清丸，分别按“1.2.1”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件分别进样5 μL，每批次样品取样2份，并进行2次平行测定，以外标法计算含量，平均值结果见表2。

表2 芎菊上清丸中7个活性成分的含量测定结果（mg/g）Tab.1 The contents of seven active ingredients in Xiongju Shangqing pills（mg/g）

3 讨论

3.1 提取条件的选择 本实验分别采用超声提取、加热回流方法对芎菊上清丸中7个成分的提取效率进行考察，结果表明采用超声提取法提取时效率更高，且相对简便易行；提取溶剂考察水、60%甲醇溶液、甲醇、乙酸乙酯等，结果表明，60%甲醇溶液与甲醇对7个成分综合提取效率最高，二者相当，考虑到溶剂成本，采用60%甲醇溶液作提取溶剂；同时对60%甲醇溶液的用量（25、50、100mL）以及超声时间（15、30、45min）进行考察，最终确定提取条件为采用60%甲醇水溶液50 mL超声处理30min。

3.2 检测波长的选择 取混合对照品溶液，采用DAD检测器，按上述色谱条件在200～400 nm范围内光谱扫描，兼顾7个成分的紫外最大吸收波长，最终确定检测波长为230 nm 0～4.5min（测定栀子苷），348 nm 4.5～9.0min（测定连翘酯苷A、绿原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸），278 nm 9.0～15.0min（测定盐酸药根碱、黄芩苷、盐酸小檗碱）。

3.3 流动相的确定 由于待测组分多，本实验采用HPLC梯度洗脱结合可变波长进行含量测定，分别考察3种溶剂系统：甲醇-水、乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸水溶液，结果以乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相的峰型较好，分离效果较理想。参照相关文献的液相洗脱条件［4-7］，最终确定梯度洗脱条件。在15min内完成对芎菊上清丸中7个活性成分的同时分析测定，大大缩短了分析时间。

3.4 测定成分的选择 芎菊上清丸现行标准为《中国药典》2010年版一部，含量测定方法为薄层色谱扫描法检测黄连中盐酸小檗碱含量。芎菊上清丸由菊花、黄芩、连翘、黄连等15味中药材制成，现行标准不能检测出多种药材的有效成分，且该方法基本上是在开放体系中进行，因此影响定量结果的因素较复杂，准确性和重复性差，影响药品质量的评价，不能有效的对药品质量进行监测。本文同时测定处方中5味主要中药材的7个有效活性成分，并进行定量分析，可以整体反映芎菊上清丸产品质量，并节约提取溶剂及缩短分析时间。

本文采用RP-HPLC梯度洗脱法在同一色谱条件下变换检测波长同时对处方中5味药材的7个特征性成分（栀子苷、连翘酯苷A［6-7］、绿原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸［8-9］、盐酸药根碱［10-11］、黄芩苷［12］、盐酸小檗碱［13-14］）进行含量测定，具有准确、简单、快捷的特点，简化了多次制备供试品溶液及流动相的繁琐步骤，节约分析时间。采用该方法可有效的控制芎菊上清丸的质量，为芎菊上清丸质量监管提供科学依据。

［1］ 国家药典委员会，中国药典2010年版一部：675.

［2］冯波，施春玲，郝乘仪，等.RP-HPLC法测定芎菊上清丸中黄芩苷［J］.中草药，2009，40(5）：743.

［3］王强，郝乘仪，冯波.RP-HPLC法测定芎菊上清丸中绿原酸的含量［J］.吉林医药学院学报，2009，30(4）：187.

［4］王永伟，赵万顺，宋新波，等.芎菊上清丸质量控制的研究［J］.辽宁中医药大学学报，2009，11(5）：178.

［5］ 郜凤香，梁艳.高效液相色谱法测定芎菊上清丸中栀子苷含量［J］.中国药业，2012，21(23）：14.

［6］ 齐翠翠，李竞，高英，等.太行山区不同产地连翘中连翘苷、连翘醋苷A的含量测定［J］.北方药学，2014，11(1）：1.

［7］ 佟若菲，张囡，林宏.HPLC法测定病毒合剂中黄芩苷、绿原酸和连翘酯苷A［J］.现代药物与临床，2014，29(3）：259.

［8］ 王英锋，谢亮亮，刘锁兰，等.HPLC法测定杏香兔耳风中绿原酸和3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量［J］.药物分析杂志，2009，29 (3）：430.

［9］ 茅纯，郑娟，邹耀华，等.高效液相色谱法同时测定桑菊感冒片中绿原酸、木犀草苷和3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量［J］.中华中医药学刊，2014，32(1）：193.

［10］陈芳，邓雁如，许妍妍，等.双波长HPLC同时测定黄连及金芪降糖片中6种生物碱的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19 (17）：60.

［11］施法，白旭东，董斌，等.HPLC法同时分析测定明目上清片中10个化学成分［J］.药物分析杂志，2014，34(1）：91.

［12］牟英迪，林吉茂.HPLC程序波长法测定牛黄上清丸中黄芩苷、连翘苷和盐酸小檗碱［J］.中成药，2013，35(9）：1933.

［13］匡艳辉，朱晶晶，王智民，等.一测多评法测定黄连中小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱、药根碱含量［J］.中国药学杂志，2009，44 (5）：390.

［14］郝乘仪，郭淑英，冯波，等.RP-HPLC法同时测定芎菊上清丸中绿原酸、盐酸小檗碱和黄芩苷的含量［J］.药物分析杂志，2014，34 (1）：193.

（编校：吴茜）

Simultaneous determ ination of seven active ingredients in Xiongju Shangqing pills by HPLC

SUN Cheng-hao1，WANG Ji-hua2

（1.Liaoyang Central Hospital，Liaoyang 111000，China；2.Liaoyang Institute for Food and Drug Control，Liaoyang 111000，China）

ObjectiveTo establish amethod for simultaneous determination of seven active ingredients（Jasminoidin，Forsythoside A，Caffeotannic acid，3，5-Di-O-caffeoylquinic acid，Jatrorrhizine Hydrochloride，Baicalin，Berberine Hydrochloride）.MethodsThe determination was carried outwith Agilent Poroshell120 SB-C18（100mm×3.0mm，2.7μm）；The mobile phase consisted of acetonitrile（A）-0.1%phosphoric acid solution（B）with gradient elution at a flow rate of 1.0mL/min；The detection wavelengthswere 230 nm in 0～4.5min（determination of Jasminoidin），348 nm in 4.5～9.0min（determination of Forsythoside A，Caffeotannic acid，3，5-Di-O-caffeoylquinic acid），and 278 nm in 9.0～15.0 min（determination of Jatrorrhizine Hydrochloride；Baicalin；Berberine Hydrochloride）.ResultsThe calibration curveswere linear in the ranges of4.024～80.48μg/mL for Jasminoidin（r=0.9991），2.042～40.84μg/mL for Forsythoside A（r=0.9993），3.956～79.12μg/mL for Caffeotannic acid（r=0.9996），6.090～121.80μg/mL for 3，5-Di-O-caffeoylquinic acid（r=0.9990），4.026～80.52μg/mL for Jatrorrhizine Hydrochloride（r=0.9995），3.924～78.48μg/ mL for Baicalin（r=0.9998），6.030～120.6μg/mL for Berberine Hydrochloride（r=0.9998）.The average recoveries（n=6）were 96.5%，97.5%，95.9%，98.6%，99.8%，98.4%and 97.3%；RSDs were 1.5%，1.3%，1.2%，1.4%，1.2%，1.1%and 0.9%respectively.ConclusionThe method is simple and repeatable，which can be applied to the quality control of Xiongju Shangqing pills.

Xiongjushangqing pills；HPLC；content determination

R917

A

1005-1678(2014）07-0177-04

辽宁省教育厅高等学校科研计划（20100352）

孙承浩，男，本科，副主任药师，研究方向：临床药学，E-mail：sunchenghao_s@163.com。