雷帕霉素对胶质瘤患者瘤体解旋酶RECQ1表达的影响研究

郭成永，梁朝辉，魏可欣，孙国柱，焦保华Δ，赵宗茂

（1.河北医科大学第二医院神经外科，河北石家庄050011；2.保定市第一医院神经外科，河北保定071000）

雷帕霉素对胶质瘤患者瘤体解旋酶RECQ1表达的影响研究

郭成永1，梁朝辉1，魏可欣2，孙国柱1，焦保华1Δ，赵宗茂1

（1.河北医科大学第二医院神经外科，河北石家庄050011；2.保定市第一医院神经外科，河北保定071000）

目的探讨雷帕霉素对脑胶质瘤患者瘤体解旋酶RECQ1(Tumor helicase RECQ1）表达的影响。方法选取河北医科大学第二医院神经外科收治的脑胶质瘤患者50例，随机分为2组，其中对照组25例，予常规手术治疗；实验组25例，先予以雷帕霉素胶囊，1mg，1次/天口服，连续服用14天，停药后1周行手术治疗。术中取胶质瘤组织样本，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR）技术和Western blot技术检测瘤体解旋酶RECQ1 mRNA和蛋白质表达。结果对照组患者胶质瘤组织瘤体解旋酶RECQ1 mRNA表达较实验组胶质瘤组织明显升高，对照组光密度值为(1.657±0.748），而实验组光密度值为(1.059±0.894），统计分析结果显示，差异有统计学意义(P＜0.05）；所有组织中瘤体解旋酶RECQ1蛋白均有表达，但实验组患者的胶质瘤组织中的瘤体解旋酶RECQ1蛋白表达(0.952±0.021）明显低于对照组(1.211±0.024），差异有统计学意义(P＜0.05）。结论雷帕霉素胶囊能够降低解旋酶RECQ1 mRNA表达，能够抑制脑胶质肿瘤细胞DNA的复制，有效杀灭癌细胞，控制脑胶质瘤的发展，改善预后，对临床具有指导意义，值得临床推广。

雷帕霉素；胶质瘤；RECQ1

神经胶质瘤（glioma）也称胶质细胞瘤，是颅内最常见的恶性肿瘤，约占全部颅内肿瘤的40%～50%，根据起源的细胞成分分为星形细胞瘤，少突胶质细胞瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤，多形性胶质母细胞瘤［1］。本病临床表现为颅内压增高症状如头痛、视神经乳头水肿、呕吐等以及肿瘤压迫脑组织所表现出来的体征，如视觉障碍、感觉障碍、语言障碍、运动障碍、病理反射阳性等［2］。本病多发于20～50岁人群，据调查统计［3］，我国原发性颅内胶质细胞瘤的年发病率为3.5～6.3/10万，并有逐年上升趋势。随着医疗技术的发展，本病人们更加重视疾病防治及预后，现代医学多采取手术治疗等疗法，但术后极易复发，且术后并发症严重，患者痛苦较大［4］。研究发现［5］，雷帕霉素能够抑制肿瘤细胞DNA的复制，阻止癌细胞的繁殖，为手术彻底切除癌细胞带来可能，提高术后疗效，缓解患者痛苦，减轻不良反应，改善其预后等。通过观察瘤体解旋酶RECQ1 mRNA和蛋白质表达，来探究雷帕霉素对脑胶质瘤患者的临床疗效，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年7月～2013年8月河北医科大学第二医院以脑胶质细胞瘤为诊断而收入院患者50例，采用随机数字表分为实验组和对照组。实验组25例，其中男19例，女6例，平均年龄（43.16±14.35）岁，星形细胞瘤10例，少突胶质细胞瘤3例，室管膜瘤6例，髓母细胞瘤1例，多形性胶质母细胞瘤5例；对照组25例，其中男21例，女4例，平均年龄（44.01± 13.64）岁，星形细胞瘤11例，少突胶质细胞瘤4例，室管膜瘤5例，髓母细胞瘤1例，多形性胶质母细胞瘤4例。患者病程0.4～2.1年，平均病程（1.6±0.4）年。2组患者的一般资料相仿，差异无统计学意义。

1.2 诊断标准 ①临床表现：颅内压增高症状如头痛、视神经乳头水肿、呕吐等；②体征：肿瘤压迫脑组织所表现出来的体征，如视觉障碍、感觉障碍、语言障碍、运动障碍、病理反射阳性等；③CT或MRI可见脑组织占位性病变；④肿瘤标记物NSE持续增高；⑤病灶组织病理活检，是诊断金标准，可明确诊断及区分病理级别［6］。

1.3 纳入标准 符合脑胶质细胞瘤的诊断标准；患者自愿参与本实验，并签署知情同意书；本实验经本院伦理学委员会批准。

1.4 排除标准 心、肝、胆严重疾病；其他恶性肿瘤；患有艾滋病、病毒性肝炎等传染病患者；神志异常以及近2个月来接受抗肿瘤治疗的患者。

1.5 治疗方法 50例患者入院后，行常规入院检查，排除手术及麻醉禁忌症，对照组行开颅切除脑肿瘤手术，参照临床用药指南，术前给予雷帕霉素胶囊（华北制药股份有限公司，国药准字H20100078），1mg，1次/天口服，连续服用14 d，停药1周后行手术治疗，手术方式、主刀医生、器械护士与对照组相同。术中2组选取2组患者脑胶质瘤组织，所有标本采集后立即保存在-70℃深低温冰箱中。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 RNA提取：用SYBR GreenⅠReal-Time PCR方法检测人体脑胶质瘤细胞中目的基因mRNA转录水平的变化情况。用超纯RNA提取试剂盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581）提取组织样本中总RNA，引物序列见表1。实验操作按产品说明书进行，用紫外分光光度法测定RNA的含量。

表1 目的基因的实时定量RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequence of the target gene

1.6.2 逆转录：用HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744）进行反转录，实验操作按产品说明书进行，将RNA模板、引物、5×RT Buffer和RNase-freeWater溶解并置于冰上备用。将2μL Primermix试剂和10μL消化后RNA分别加入20μL反应体系的第一部分，混匀。65℃孵育5min，迅速冰浴2min，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。继续向以上反应管中加入4μL 5×RT Buffer、2μL 0.1M DTT、1μL 10mM dNTP Each和1μL HiFi-MMLV Enzyme Mix试剂，轻轻吸打混匀，37℃孵育50min，70℃保温10min。

1.6.3 PCR扩增产物相对定量分析：PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，溴化乙啶染色，通过成像分析scion软件计算和比较RECQ1产物条带的吸光度值，并与β-action条带光密度值比较，计算出RECQ1在脑胶质瘤组织中mRNA表达含量。

1.6.4 Western blot分析：将准备好的组织匀浆加入裂解液中，提取胞浆蛋白和膜蛋白进行电泳，电转移到PVDF膜后依次加RECQ1多克隆抗体和相应的第二抗，洗膜，放射自显影后，洗像。用图像采集和分析系统采集分析图片，测定2组的吸光密度。

1.7 统计学方法 采用统计学软件SPSS17.0进行统计学分析，正态计量数据用“±s”表示，正态资料组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑胶质瘤组织中瘤体解旋酶RECQ1mRNA的表达RTPCR结果 实验组脑胶质瘤组织中瘤体解旋酶RECQ1mRNA的表达较对照组脑胶质瘤组织明显减少，实验组光密度值为（1.059±0.894）；对照组相应条带吸收光密度值为（1.657± 0.748）。统计学分析得出，2组瘤体解旋酶RECQ1mRNA表达比较存在差异，差异有统计学意义（t=2.487，P＜0.05，见表2、图1）。

表2 瘤体解旋酶RECQ1mRNA相对表达比较情况Tab.2 Comparison of tumor helicase RECQ1mRNA relative expression

图1 脑胶质瘤组织内RECQ1mRNA表达1-3，实验组；4-6，对照组Fig.1 Expression of RECQ1mRNA in brain glioma tissue 1-3，experiment group；4-6，control group

2.2 脑胶质瘤组织中瘤体解旋酶RECQ1 Western blot结果

Western blot分析结果所示：2组脑胶质瘤组织中瘤体解旋酶RECQ1均有蛋白表达，实验组脑胶质瘤组织中瘤体解旋酶RECQ1蛋白表达（0.952±0.021）显著低于对照组（1.211± 0.024），差异有统计学意义（t=2.684，P＜0.05），与RT-PCR结果相同，如表3、图2。

表3 脑胶质瘤组织瘤体解旋酶RECQ1蛋白电泳带的灰度值Tab.3 Electro phoresis brand gray value of brain glioma tumor helicase RECQ1 protein

图2 脑胶质瘤组织中瘤体解旋酶RECQ1蛋白表达（Western blot）1-2为实验组，3-5为对照组Fig.2 Expression of glioma tumor helicase RECQ1 protein 1-2，experiment group；3-5，control group

3 讨论

胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤，来源于神经外胚层，其中以星形细胞瘤最常见，约占40%，其次为恶性度最高的多形性胶质母细胞瘤，约占20%。目前主要是以手术联合放化疗治疗为主，但是手术难以根除，对放、化疗不敏感，术后复发率高，术后并发症多，5年生存率低［7］。因此如何诱导恶性肿瘤细胞凋亡、控制细胞增殖、治愈胶质细胞瘤成为目前研究的热点难题［8］。最近研究表明［9］，RECQ1在大肠癌、甲状腺癌、非小细胞肺癌、多形性胶质母细胞瘤中存在高表达，并且RECQ1与恶性肿瘤患者预后差相关，因此如何抑制RECQ1，控制癌细胞的凋亡率，是现代治疗脑胶质细胞瘤新的治疗思路。

本实验RT-PCR结果显示，实验组脑胶质瘤组织中瘤体解旋酶RECQ1mRNA的表达较对照组脑胶质瘤组织明显减少，实验组光密度值为（1.059±0.894）；对照组相应条带吸收光密度值为（1.657±0.748）。统计学分析得出，2组瘤体解旋酶RECQ1mRNA表达比较存在差异，差异有统计学意义（P＜0.05）；Western blot分析结果示：2组脑胶质瘤组织中瘤体解旋酶RECQ1均有蛋白表达，实验组脑胶质瘤组织中瘤体解旋酶RECQ1蛋白表达（0.952±0.021）显著低于对照组（1.211± 0.024），差异有统计学意义（P＜0.05），与RT-PCR结果相同。RT-PCR和Western blot分析结果证明，雷帕霉素胶囊能够抑制脑胶质瘤组织中瘤体解旋酶RECQ1 mRNA和蛋白的表达，控制癌细胞的DNA复制，诱导细胞凋亡。RecQ解旋酶是一类参与细胞内DNA复制、修复、转录重组以及RNA接拼、核糖体组装、蛋白质翻译，端粒稳定的核苷酸酶，而RECQ1是RecQ解旋酶家族成员，对肿瘤细胞增殖与诱导肿瘤细胞DNA修复起到关键调控作用。雷帕霉素又称西罗莫司，是一种既能抑制细胞增殖从G1期进入S期而阻断T淋巴细胞活化，又能阻断白细胞介素-2与其受体的结合的大环内酯抗生素类免疫抑制剂［10-13］。研究表明［14-15］，雷帕霉素又是mTOR抑制剂，mTOR是P13K/Akt信息通路激酶，在胶质细胞肿瘤增殖和发展过程中起到重要的调控作用，雷帕霉素通过抑制mTOR激酶活性，阻断P13K/Akt/mTOR信息通路在肿瘤细胞繁殖中的调控作用，起到诱导肿瘤细胞凋亡的作用。相关研究报道［16］，RECQ1表达与肿瘤恶性程度呈正相关，RECQ1在高级别胶质瘤中高表达，在低级别胶质瘤低表达，因此雷帕霉素通过抑制肿瘤细胞的繁殖，同时也抑制RECQ1表达。

综上所述，雷帕霉素能够抑制RECQ1mRNA和蛋白表达，抑制肿瘤细胞的DNA修复，抑制mTOR激酶活性，阻止肿瘤细胞增殖和发展，有效杀灭肿瘤细胞，控制脑胶质瘤的发展，提高术后疗效，降低复发率，改善患者生活质量，对临床具有指导意义，值得临床推广。

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［3］翟晓东.RECQ1解旋酶在人脑胶质瘤中的表达及意义［D］.河北医科大学，2013.

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（编校：谭玲）

Effect study of rapamycin on the expression of tumor helicase RECQ1 in glioma patients

GUO Cheng-yong1，LIANG Zhao-hui1，WEIKe-xin2，SUN Guo-zhu1，JIAO Bao-hua1Δ，ZHAO Zong-mao1

（1.Department of Neurosurgery，The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Neurosurgery，The First Hospital of Baoding，Baoding 071000，China）

ObjectiveTo investigate the effects of rapamycin on the expression of glioma patients tumor helicase RECQ1.Methods50 glioma patients admitted to the department of neurosurgery in second hospital of hebeimedical university were selected and random ly divided into 2 groups，25 patients in control group，were treated with routine admission surgical treatment；25 cases in the experimental group，firstly were given rapamycin capsule 1mg，1 times/day orally，took 14 days in a row，and had surgical treatmentafter stopping drug aweek.Glioma tissue sampleswere taken during the operation，mRNA and protein expression of tumor helicase RECQ1 were detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR）and Western blot.ResultsGlioma tumor helicase RECQ1 mRNA expression in the control group increased more significantly than experimental group，the optical density value in control group was（1.657±0.748），while the experimental group optical density valuewas（1.059±0.894），and the difference was statistically significant（P＜0.05）；allorganizations had the expression of tumor helicase RECQ1 protein，butgliomas tumor helicase RECQ1 protein expression in the experimental group patients（0.952±0.021）was significantly lower than that in the control group（1.211±0.024），and the difference was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionRapamycin capsule could reduce the expression ofmRNA helicase RECQ1，inhibitDNA glial tumor cells of brain replication，effectively kill cancer cells，control the the progress of brain glioma，and improve prognosis，worth clinical promotion.

rapamycin；glioma；tumors helicase RECQ1

R730

A

1005-1678(2014）07-0138-03

河北省卫生厅科研基金项目（20130511）

郭成永，男，硕士，主治医师，研究方向：胶质瘤，E-mail：onegcyong@126.com；焦保华，通信作者，女，博士生导师，主任医师，研究方向：胶质瘤，E-mail：jiaobh2000@163.com。