GATA-4在小鼠生殖腺中的表达定位研究

景彩霞，杨加周，庞秋霞，艾庆燕，王艳梅，赵豫凤

(1.延安大学医学院寄生虫教研室；2.组织胚胎教研室；3.生物化学教研室，陕西 延安 716000)

GATA家族可分为GATA-1、-2、-3和GATA-4、-5、-6两个亚家族，前者主要在造血干细胞中表达，后者主要在内胚源和中胚源组织(如心脏、睾丸和卵巢等)中表达。该家族每个转录因子都含有两个锌指组成的一个高度保守的DNA结构域，在此之外的序列则有较大的差异[1]。自1996年Huang等研究者应用荧光原位杂交技术将GATA-4基因定位于人8p23.1→p22染色体上[2]之后。大量研究结果表明GATA-4在动物生殖细胞的分化和生殖过程中多种激素的调节上可能起着必不可少的作用[3]。本课题组为了探讨GATA-4在睾丸性别决定和分化以及卵巢中卵泡的发育、闭锁等方面的调控，对小鼠睾丸和卵巢内GATA-4免疫反应产物的分布与特征进行研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 生长转录因子GATA-4IgG多克隆抗体，由美国Santa公司(Santa Cruz Biotechnogy,Inc)提供；生物素标记的兔抗羊IgG(GAR-b)和辣根过氧化物酶标记链霉卵白素(Streptavidin/HRP)等试剂来自美国Sigma公司产品。对照试剂正常山羊抗体，甲基绿等由日本Nagoya公司提供。

1.1.2 动物 选取由日本Kanagawa公司提供来源于美国癌症研究所的雌性和雄性小鼠各6只，饲养室温度及湿度与外界环境一致，定时定点常规投喂食物。

1.2 方法

1.2.1 取材及组织处理 选用同一批次6周龄雌雄小鼠各6只，用乙醚将实验小鼠麻醉，称重后快速取出雌性小鼠卵巢和雄性小鼠睾丸，置于含4%的多聚甲醛固定液中待用。将组织切成0.5 cm3左右大小的方块，在4%的多聚甲醛溶液中充分固定24h后，用PH为7.4的0.01 mol/L PBS液洗3次，并进行脱水、包埋，制成5 μm厚石蜡切片。

1.2.2 免疫组化-ABC法 先将石蜡组织切片在60℃恒温箱中烘烤20 min后，经二甲苯及酒精脱蜡和水化，PBS清洗2次，用水浴锅加热放入组织切片的0.01 M枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)95℃左右10 min，进行抗原修复。待缓冲液冷却后用PBS浸泡，用0.3%H2O2室温封闭以消除内源性过氧化物酶。PBS液洗3次，滴加5%正常山羊血清室温下封闭60 min。滴加稀释的一抗GATA-4 IgG(1∶100)，4℃冰箱孵育24 h，PBS冲洗3次，每次5 min。滴加生物素化羊抗免二抗作1∶100倍稀释，室温孵育30 min，PBS洗涤；辣根过氧化物酶标记链霉卵白素(1∶100)，滴加在切片上，室温孵育30 min，再用PBS洗涤；DAB显色；蒸馏水冲洗，甲基绿复染。对照组的一抗用正常山羊抗体代替，其余步骤同上。

2 结果

在6周小鼠的睾丸组织中Sertoli细胞、Leydig细胞和生精细胞(图A)均有GATA-4的表达，说明本实验显示阳性结果具有特异性。6周小鼠的卵巢组织中初级卵泡和次级卵泡的颗粒细胞中GATA-4的表达较多，卵泡膜细胞上有少量的分布(图C)。阴性对照组的一抗用正常山羊抗体代替，结果均为阴性无明显表达产物(见图B、图D)。

A 小鼠睾丸组织GATA-4免疫组化结果(黑色箭头示Sertoli细胞，白色空心箭头示Leydig细胞，红色箭头示生精细胞。)B 小鼠睾丸组织阴性对照C 小鼠卵巢组织GATA-4免疫组化结果(黑箭头示颗粒细胞，红箭头示卵泡内膜细胞。)D 小鼠卵巢组织阴性对照

3 讨论

GATA家族可在哺乳动物生殖腺中的多种细胞中表达，参与动物的性别决定和生殖功能，在调控生殖系统中扮演着重要的角色[4，5]。Sertoli细胞具有营养生精细胞和调节生精细胞周期作用的体细胞，胚胎时期Sertoli细胞分泌抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)使中肾管发育，中肾旁管退化，胚胎发育为男性。GATA-4转录因子能与SF-1转录因子协同调节，从而激活AMH启动报告基因的活性，使雄激素增强中肾管系统的发育和中肾旁管的单向退化，进而影响性别分化[6，7]。反之在胚胎时期缺乏Sertoli细胞分泌AMH，使中肾旁管发育，中肾管退化，胚胎发育为女性。小鼠性成熟期一般在6周龄，笔者研究发现GATA-4在6周的小鼠Sertoli细胞和Leydig细胞中阳性表达，这与精子的成熟与GATA-4对Sertoli细胞和Leydig细胞的调控有关[8]相一致。GATA-4还在小鼠的胎儿期的生精细胞与性成熟期的生精细胞有表达，推测其可能参与精子的发生过程的调节，这与Ketola等[9]报道的有所不同。

卵泡发育是由原始卵泡到初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡至排卵的一个复杂过程，其显著特征是仅有少数卵泡发育成熟，大多数卵泡则闭锁退化。2001年Vaskivuo等[10]研究认为卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡有关，颗粒细胞凋亡在发育晚期卵泡闭锁中起主导作用。国外研究表明GATA-4参与动物和人的卵泡发育并在卵泡发育过程的颗粒细胞中表达，其在颗粒细胞中的表达水平随着颗粒细胞增殖活性而增加[7，11]。即在优势卵泡的颗粒细胞中GATA-4的表达量随着卵泡发育不断增高，卵泡发育至排卵前状态时GATA-4 mRNA表达到最高值。而在非优势卵泡中，GATA-4在所有颗粒细胞中的表达在卵泡通过程序性死亡发生卵泡闭锁之前急剧下降[11，12]。本次实验结果显示6周龄小鼠的卵巢组织中初级卵泡和次级卵泡的颗粒细胞中GATA-4的表达较多，卵泡膜细胞上有少量的表达。

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是由下丘脑合成的十肽激素，主要功能是控制卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)的释放，在性别分化、性腺发育以及生殖过程中起重要调节作用。Lawson等[13]研究表明GATA-4对GnRH的特异性表达起着重要的调节作用，会诱导GnRH的大量分泌即影响FSH和LH等激素，从而调控了睾丸和卵巢激素的分泌。本实验发现6周小鼠的睾丸中阳性Sertoli细胞和Leydig细胞及卵巢的各期卵泡中的阳性颗粒细胞和少量的卵泡内膜细胞，故推测GATA-4可能参与睾丸中雄激素的分泌与调节，在维持睾丸内环境的稳定的同时参与了精子的发生与形成，尤其是GATA-4在青春期前后的睾丸细胞内表达量较高。另外GATA-4在优势卵泡的颗粒细胞中的持续表达可促进颗粒细胞的增殖分化和通过颗粒细胞和卵泡内膜细胞调节卵泡的凋亡、成熟和排卵，调控了月经周期和内环境的稳定。至于GATA-4通过何种途径促进颗粒细胞增殖分化和抑制颗粒细胞凋亡，GATA-4基因发生突变或者敲除该基因是否会阻断卵泡的发育或闭锁过程等问题还有待进一步探索。

参考文献：

[1]Morrisey EE,Ip HS,Lu MM,et al.A zinc finger transcription factor that is expressed in multiple cell lineages derived from lateral mesoderm.J Dev Biol,1996,177:309-322.

[2]Huang W Y,Heng H H,Liew C C.Assignment of the human GATA4 gene to 8p23.1→p22 using fluorescence in situ hybridization analysis[J].Cytogenet Cell Genet,1996,72(2-3) :217-218.

[3]Tremblay JJ,Viger RS.GATA factors differentially activate multiple gonadal promoters through conserved GATA regulatory elements.Endocrinollgy,2001,142(3):977-986.

[4]景彩霞，杨加周，艾庆燕，等.GATA家族与生殖.中华男科学杂志，2009，15(10)：932-936.Jing CX,Yang JZ,Ai QY,et al.Zhonghua Nan Ke Xue Za Zhi,2009，15(10)：932-936.

[5]Bielinska M,Seehra A,Toppari J,et al.GATA-4 is required for sex steroidogenic cell development in the fetal mouse[J].Dev Dyn.2007,236(1):203-213.

[6]LaVoie HA.The role of GATA in mammalian reproduction.Exp Biol Med ( Maywood),2003,228(11):1282-1290.

[7]Tremblay JJ,Robert NM,Viger RS.Modulation of endogenous GATA-4 activity reveals its dual contribution to M?llerian-inhibiting substance gene transcription in Sertoli cells.Mol Endocrinol,2001,15(9):1636-1650.

[8]Bielinska M,Seehra A,Toppari J,et al.GATA-4 is required for sex steroidogenic cell development in the fetal mouse.Dev Dyn.2007,236(1):203-213.

[9]Ketola I,Rahman N,Toppari J,et al.Expression and regulation of transcription factors GATA-4 and GATA-6 in developing mouse testis.Endocrinology,1999,140(3):1470-1480.

[10]Vaskivuo TE,Anttonen M,Herva R,et al.Survival of human ovarian follicles from fetal to adult life:apoptosis,apoptosis-related proteins,and transcription factor GATA-4.Clin Endocr Metab,2001,86( 7) :3421-3429.

[11]Gillio-Meina C,Hui YY,LaVoie HA.GATA-4 and GATA-6 transcription factors:expression,immunohistochemical localization,and possible function in the porcine ovary.J Biol Reprod,2003,68 (2):412-422.

[12]Laitinen MP,Anttonen M,Ketola I,et al.Transcription factors GATA-4 and GATA-6 and a GATAfamily cofactor,FOG-2,are expressed in human ovaryand sexcord-derived ovarian tumors.Clin Endocrinol Metab,2000,85( 9) :3476-3483.

[13]Lawson MA,Mellon PL.Expression of GATA-4 in migrating gonadotropin-releasing neurons of the developing mouse.Mol Cell Endocrinol,1998,140 (1-2):157-161.