游离型HPV16细胞类型特异性增强子片段的变异对启动子活性的影响

李 玲，刘文康，楚雍烈，刘 湘，任健康

(1.陕西省人民医院检验科，陕西 西安 7100682.西安交通大学基础医学院病原生物系，陕西 西安 710061)

宫颈癌是最常见的妇科肿瘤之一。大量流行病学和分子生物学资料已证实，宫颈癌发生与人类乳头瘤病毒(Human Papillomavirus ,HPV)感染有密切关系。高危型HPV致癌机制为HPV基因组与宿主细胞染色体整合后，其E2蛋白阅读框发生缺失，使病毒癌基因E6/E7表达缺乏E2蛋白的抑制，导致癌基因表达增强，诱导细胞恶性变[1-2]。然而部分宫颈癌组织中只发现游离型HPV，其致癌机制尚未完全清楚。HPV 长控制区(LCR)内含有乳头瘤病毒基因组复制起点和基因表达所必需的调控元件。LCR中的细胞型特异性增强子(Cell-type Specific Enhancer,CTSE)含一系列细胞因子特异结合位点。研究发现，HPV16长控制区的变异现象较为普遍，其变异对E6/E7癌基因的转录和表达影响以及在宫颈癌发生发展中起着重要作用。而且在HPV16 LCR内的变异多发生在CTSE片段中[3]， 这提示CTSE片段可能在致癌机理方面有重要的作用。本实验室曾对来自陕西省的宫颈癌标本进行研究，发现宫颈癌组织中游离型HPV16 CTSE片段存在特定的变异，即存在nt7481-nt7489处YY1位点突变[4]。YY1位点突变有可能使YY1蛋白丧失对HPV16 E6/E7癌基因P97启动子活性的抑制,导致E6/E7癌基因表达增强。显然，实验证明上述位点突变对启动子功能的影响，对于了解游离型HPV16致宫颈癌的分子机理是十分必要的。

1 材料与方法

1.1 实验材料

宫颈癌组织为本室先前证实并保存的携带游离型HPV16的宫颈癌组织标本。其CTSE片段序列突变(nt7480-nt7482,A→C的替换)。质粒pUC19和PBR322/HPV16质粒由本室保存。pUCm-T载体购自上海生工生物有限公司，pCAT3-Promoter(含SV40启动子，启动子上游为多克隆位点，可插入调节启动子活性的序列；下游为CAT报道基因)载体购自Promega公司。DMEM购自GIBCO BRL 公司。过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G购自北京鼎国生物技术发展中心。抗CAT蛋白抗体，预防医学科学院病毒所高晨博士惠赠。大肠杆菌JM109株，本室保存。HeLa细胞，本室保存。

1.2 方法

1.2.1 构建含HPV16 突变型及野生型CTSE片段的中间载体 分别以HPV16质粒及1例存在游离型HPV16的宫颈癌标本DNA(已测序证实其CTSE序列存在突变位点)为模板,设计CTSE片段特异性引物进行PCR反应，扩增出野生型及突变型CTSE片段。 引物1：5’—GAATTCGGTTGCATG CTTTT—3’引物2：5’—ACTAGGGTGACATTTAGTTGG—3’按pUCm-T试剂盒操作说明，将PCR产物CTSE片段与pUCm-T连接。连接产物转化JM109大肠杆菌，蓝白斑筛选工程菌。挑取白色菌落提取重组质粒，分别命名为pUCm-T-CTSE1(野生型)和pUCm-T-CTSE2(游离突变型)，进行PCR扩增、酶切分析及测序。

1.2.2 野生型及突变型CTSE-CAT报道载体的构建

将分别含野生型及突变型CTSE-T载体进行Kpn I+Bgl II双酶切，回收野生型及突变型CTSE片段，再与同样双酶切的pCAT3-Promoter报道基因载体进行连接反应。转化大肠杆菌JM109，培养并提取质粒DNA。重组质粒分别命名为pCAT-1(野生型)，pCAT-2(游离突变型)。

1.2.3 细胞转染 常规培养HeLa细胞。转染前一天给HeLa细胞换液，细胞丰度达到90%时，按Lipofectamine 2000操作说明进行转染。37℃细胞培养箱中培养48 h，收获细胞。-70℃反复冻溶3次，离心取上清。

1.2.4 细胞提取物中CAT蛋白ELISA检测 将稀释的细胞提取液包被后，5%的小牛血清/PBS封闭抗原孔。加入抗CAT蛋白抗体(工作浓度1∶500)，37℃温育1 h，洗涤后加入过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(工作浓度1∶400)， 最后加入TMB底物缓冲液，室温15 min，加入终止液。测OD450值。

2 结果

2.1 HPV16 野生型及突变型CTSE-T载体酶切分析

取白色菌落培养并提取质粒 DNA进行电泳初筛，选取质粒DNA分子量较大的菌落提取质粒DNA进行PCR扩增分析及Kpn I+Bgl II双酶切分析。酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳可见两条带，其中大片段分子量约2.7 kb，落后于重组pUCm-T质粒(3 kb); 小片段分子量约为0.3 kb，与预期相符，证明插入了目的基因。

1.Lambda DNA/HindIII Marker 2.pUCm-T-CTSE1质粒 3.pUCm-T-CTSE2质粒 4.pUCm-T-CTSE1酶切产物 5.pUCm-T-CTSE2酶切产物 6.HPV16质粒DNA PCR扩增产物 7.100bp DNA LadderIII

2.2 DNA测序及序列比对结果

游离型HPV16 CTSE序列测序结果与原测序结果一致。与野生型HPV16 CTSE序列部分相比，nt7480，nt7481，nt7482处(下划线处)发生A→C颠换。

图2 游离型HPV16 CTSE序列突变位点

2.3 HPV16野生型及突变型CTSE-CAT报道载体酶切分析

挑取37℃培养24 h的氨苄青霉素抗性LB平板上菌落，培养并提取质粒DNA进行电泳初筛，选出分子量相当于4.6 kb的菌落，提取质粒DNA进一步进行Kpn I+Bgl II双酶切分析。酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳可见两条带，其中大分子片段分子量约4.3 kb与空载体相当；小片段分子量约为0.3 kb，与预期相符，证明插入了目的基因。

1.Lambda DNA/Hind Ⅲ Marker 2.pCAT3-Promoter质粒 3.pCAT-1质粒 4.pCAT-2质粒 5.pCAT-1酶切产物 6.pCAT-2酶切产物 7.100 bp DNA LadderⅢ

2.4 CAT报道基因瞬时表达检测结果

转染细胞48 h后，与转染无增强子的CAT报道质粒pCAT3-Promoter相比，插入HPV16 CTSE 序列的重组报道质粒(pCAT-1，pCAT-2) 的CAT蛋白表达量增加1.5～2.5倍。而插入突变型CTSE 序列的报道质粒(pCAT-2)与插入野生型CTSE 序列报道质粒(pCAT-1)相比,CAT蛋白表达量增加了1.6倍。并用SPSS 10.0统计软件进行单因素方差分析，它们之间有显著性差异(P<0.01)。

图4 不同HPV16 CTSE序列控制下的CAT蛋白表达

未转染的HeLa细胞为阴性对照，CAT相对表达值为3次转染的均值(P<0.01)。

3 讨论

在宫颈癌组织中，除存在有整合型的HPV16 DNA之外，其中有10～30%的HPV16 DNA是以游离态的形式存在[5]。游离型HPV16可表达E2蛋白。在E2蛋白的存在条件下，癌蛋白仍上调表达。其上调途径的一个假说是：由于LCR上，特别是细胞型特异性增强子区转录因子结合位点的缺失或突变，导致具有抑制转录活性的蛋白的抑制作用丧失。

YY1蛋白是一种遍在化蛋白，对细胞转录有调节作用，是具有多功能的转录因子[6]。可因启动子结构的不同或细胞环境的变化起到刺激或抑制转录活性的效应。YY1蛋白可通过结合于HPV16 CTSE 上YY1位点，抑制P97启动子活性。研究发现，与其它细胞因子结合位点相比，HPV LCR序列中YY1位点突变相当多。其突变可在完整基因组范围内明显增强对小鼠纤维细胞的转化能力[7]，也可在完整基因组范围内增强病毒使人原代包皮角源细胞永生化的能力，并且可使HPV16癌基因启动子P97活性上调，E6/E7癌基因表达增强，在宫颈癌，特别是与游离型HPV相关宫颈癌的进程中起着重要作用[8]。

本研究应用 CAT报道基因载体pCAT3-Promoter，构建了含HPV16 突变型及野生型CTSE片段序列的CAT报道基因载体系统。通过测定CAT蛋白的表达变化，研究HPV16 突变型及野生型CTSE片段对启动子活性影响。结果表明，与无增强子的CAT报道质粒pCAT3-Promoter相比，插入HPV16 CTSE 序列的pCAT3-Promoter重组报道质粒CAT蛋白表达量增加1.5～2.5倍。插入游离型突变的CTSE 序列(YY1位点突变)的报道载体与插入野生型CTSE 序列报道载体相比，其CAT蛋白表达量增加了约1.6倍，并用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析(P<0.01)。表明游离型HPV16 CTSE YY1位点突变序列与野生型HPV16 CTSE序列相比，可诱导启动子活性增强。这提示来自陕西地区宫颈癌组织的游离型HPV16，其 CTSE 上YY1位点的变异可使YY1蛋白对启动子活性的抑制减弱，使病毒癌基因启动子P97活性上调，病毒癌基因表达增多，从而诱使细胞恶性转化。

本研究中，来源于陕西地区宫颈癌组织中游离型HPV16 CTSE上并没有观察到AP1,NF1,NF-IL6结合位点等重要位点的变异。同样来源的整合型HPV16 CTSE上未见YY1位点的变异。而且，整合型HPV16 LCR上存在YY1位点突变尚未见报道。这表明宫颈癌组织中游离型HPV16可能存在YY1位点的选择性突变[9-10]。其原因可能是：变异是生物适应环境和维持生存的一种重要方式。病毒侵入宿主细胞，宿主细胞必定采取各种方式对抗病毒感染，如诱导干扰素产生等。病毒面临宿主的选择压力。有利于病毒生存复制的变异有可能保留下来。对于HPV16而言，感染宿主细胞后，宿主细胞试图通过YY1蛋白来抑制病毒早期基因表达，干扰HPV16正常的基因表达过程及改变其基因调控机制。而病毒则通过自身序列YY1位点突变使细胞YY1蛋白不能与之结合，从而逃逸YY1蛋白的抑制作用，有利于HPV16生存复制。因此宫颈癌组织中游离型HPV16多呈现YY1位点突变。

值得注意的是，本研究中的CTSE突变位置在nt7480- nt7482，而且为单个YY1位点突变，与国外研究不同。因此，本实验中突变的CTSE上调启动子活性程度亦不同。本研究中的YY1位点突变，对启动子活性影响稍弱于同时有多个YY1位点突变，亦稍弱于其他YY1位点突变,如nt7777-nt7789上的YY1位点。此位点是围绕nt7813-nt7819处AP1位点的YY1位点之一，在调控E6/E7转录的表达上有重要功能，nt7786处的单个碱基变化会使启动子活性增加4～6倍突变[3]。这表明突变YY1位点位置或数量不同，对启动子活性影响也不同。

综合以上对本研究中游离型HPV16 CTSE序列突变结果、启动子活性影响的分析及国外研究，表明了陕西地区 HPV16 YY1位点的突变与游离型HPV16 DNA 导致的宫颈癌发生发展有密切联系。

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