阿维A对正常人外周血树突细胞的影响

刘丽娟 张国强 温洁新 于 亮 宣晓梅 李英涛 李艳佳

(河北医科大学第一医院皮肤科，河北 石家庄 050031)

树突细胞(DCs)是人体内“专职的”抗原提呈细胞(APC)，对于调控Th1及Th2细胞分化发挥重要的作用〔1，2〕。CD83和CD86是DCs表面表达的协同共刺激分子和特征性标志分子〔3〕。维A酸是由维生素A衍生而来的化合物，可以调控多种细胞的形态，对多种细胞的增殖、凋亡及上皮细胞和其他细胞的生长和分化等都具有广泛的生物学活性〔4〕；近年来研究发现它还具有明显的免疫调节作用。阿维A是第二代维A酸类药物，具有调节表皮细胞分化和增殖的作用〔5，6〕，在皮肤科领域主要用于银屑病及一些角化性疾病的治疗，具有较好的疗效〔7，8〕，但其作用机制与DCs的关系尚不清楚。本文拟探讨阿维A对正常人外周血DCs的影响，以期寻找阿维A治疗自身免疫性皮肤病的实验基础及理论依据。

1 材料与方法

1.1标本来源 健康献血成人20例，男12例，女8例，年龄20～48岁，平均34岁，抽血前至少2个月内均未系统应用过皮质类固醇及免疫抑制剂。抽血前均签署知情同意书。

1.2主要仪器及试剂 Epics-XL Ⅱ型流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司；阿维A，重庆华邦有限公司惠赠；鼠抗人CD83-FITC单克隆抗体(HB15a)、鼠抗人CD86-PE单克隆抗体(HA5.2B7)，美国Beckman Coulter公司；IL-12 ELISA试剂盒，上海西唐生物科技有限公司。重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)及重组人白介素-4(rhIL-4)，PEPROTECH Asia公司。

1.3人外周血DCs的制备 取健康成人外周静脉血30 ml(肝素抗凝)，使用淋巴细胞分离液常规方法分离制备外周血单个核细胞(PBMC)。生理盐水洗涤细胞3次。用含15%胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为5×109个/L，加入到6孔培养板中(3 ml/孔)，放入37℃和5% CO2培养箱中培养3 h后，弃去培养液，用37℃预温的RPMI1640培养液轻轻洗去未贴壁的细胞，所获得的贴壁细胞即为拟诱导DCs的单核细胞。向6孔板中每孔贴壁细胞中加入含有15%胎牛血清、50 μg/L rhIL-4和rhGM-CSF细胞因子的RPMI1640培养液3 ml，放入37℃和5% CO2培养箱中培养，隔日半量换液(吸出30%，加入60%)。同时补充相应的细胞因子。每次换液吸出的培养液均用离心机离心保留培养液中悬浮的细胞。培养6 d后收集悬浮的细胞，即诱导的DCs。

1.4阿维A药物干预 当DCs培养的第7天，向培养液中加入不同浓度的阿维A，使其药物浓度分别达到1 nmol/L和10 nmol/L，对照组只加培养液，每组设3个复孔。同时补充相应的rhIL-4和rhGM-CSF细胞因子，继续置于37℃和5%CO2培养箱中培养，加药后培养12 h后进行流式细胞术(FCM)及酶联免疫吸附实验检测。

1.5FCM检测DCs表型 将收集的DCs用生理盐水洗涤2次，调整细胞浓度为1×1010个/L，每例标本取细胞悬液0.6 ml 分别放入4个试管(0.1 ml/管)，分别加入CD83、CD86及相应的同型对照抗体。混匀后，室温避光放置30 min，生理盐水洗涤细胞2次，加入1 ml生理盐水，上流式细胞仪检测。

1.6酶联免疫吸附实验(ELISA)检测DCs分泌IL-12细胞因子含量 将实验中收集到的细胞培养液，利用常规的ELISA实验方法检测IL-12表达量，具体操作步骤按照IL-12 ELISA试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1FCM检测DCs中CD83、CD86表达水平 体外成功培养出DCs(图1)。1 nmol/L和10 nmol/L阿维A作用DCs 12 h后，健康成人外周血DCs中CD83表达率分别为(56.65±7.09)%、(63.82±5.81)%，显著高于阴性对照组〔(43.55±4.32)%〕(P<0.05)；CD86表达率分别为(65.43±1.79)%、(73.73±2.10)%显著高于阴性对照组〔(52.96±1.10)%〕(P<0.05)。

2.2ELISA检测DCs分泌IL-12细胞因子含量 1 nmol/L和10 nmol/L阿维A作用DCs 12 h后，健康成人外周血DCs分泌到细胞培养液中的IL-12表达水平分别为(51.377±4.527)、(60.659±4.973) pg/ml，显著高于对照组〔(39.927±2.809) pg/ml〕(P<0.05)，且10 nmol/L组较1 nmol/L阿维A组显著提高(P<0.05)。

阿维A作用前

1 nmol/L阿维A

10 nmol/L阿维A

3 讨 论

免疫系统能否维持人体正常的免疫功能在机体生理功能衡定方面发挥至关重要的作用。免疫反应的起始首先由APC经过摄取、加工及处理抗原后，将信息传递给T、B细胞，从而引发一系列的免疫应答。DCs是体内“专职的”APC，也是激发初次免疫应答的APC，是机体免疫应答的启动者〔9〕。DCs按成熟状态的不同可分为未成熟的DCs(imDCs )和成熟的DCs(mDCs)。CD83被认为是mDCs的特征性表面标记分子，有很强的激活淋巴细胞的功能，是刺激机体产生免疫应答必不可少的调节性分子〔3〕。CD86是T细胞活化所必需的信号分子，缺乏CD86或表达量低可导致机体接触病原微生物或有害因素刺激时不能将这些抗原信息有效地传递给T细胞，不能诱导机体对本身有害的物质清除。IL-12是Th1细胞分泌的细胞因子，可以促使Th0向Th1细胞分化，调节Th1细胞介导的免疫应答。有资料表明，只有DCs成熟时才可以大量分泌IL-12〔10〕，因此IL-12的水平又是衡量DCs是否向成熟方向分化的一个指标。阿维A具有调节表皮细胞分化和增殖的作用。目前阿维A作用于DCs的研究鲜有文献报道。

本实验发现，不同浓度阿维A 作用DCs 相同时间后，CD83、CD86表达显著增加，且随阿维A浓度的增加而增强，即具有阿维A浓度依赖性。由此推测阿维A可促进DCs表面标记的表达并在一定时间上表现出剂量-效应关系。CD83、CD86的表达明显上调表明阿维A可以促使DCs向成熟方向分化，增加了DCs激活T淋巴细胞的辅助刺激信号功能，增强了DCs的抗原提呈能力，促进T细胞的增殖和活化，刺激机体产生免疫应答。同时，不同浓度阿维A 作用DCs 相同时间后，IL-12分泌量显著增加，同样具有阿维A浓度依赖性。由此推测阿维A对DCs分泌IL-12有强烈的促进作用，诱导Th0向Th1细胞分化，调节Th1细胞介导的免疫应答；同时也可影响DCs的分化，促进DCs向成熟方向分化，这与FCM检测细胞表面标记的结果一致。

综上，阿维A可影响DCs的成熟度，促进DCs向成熟方向分化，从而提高DCs的抗原提呈能力，促进T细胞的增殖和活化，诱导机体产生强烈的免疫应答而非诱导机体产生免疫耐受来调节机体的免疫系统。其机制可能与阿维A上调细胞表面标记CD83、CD86的表达和促进细胞因子IL-12的分泌有关，这为临床治疗自身免疫性皮肤病提供了新的理论依据。

4 参考文献

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2Van Schooten WC，Strang G，Palathumpat V.Biological properties of dendritic cells：implications to their use in the treatment of cancer〔J〕.Mol Med Today，1997；3(6)：254-60.

3Yilmaz T，Gedikoglu G，Celik A，etal.Prognostic significance of langerhans cell infiltration in cancer of the laryax〔J〕.Otolaryngol Head Neck Surg，2005；132(2)：309-16.

4Pino-Lagos K，Guo Y，Noelle RJ.Retinoic acid：a key player in immunity〔J〕.Biofactors，2010；36(6)：430-6.

5Ricceri F，Pescitelli L，Tripo L，etal.Treatment of severe nail psoriasis with acitretin：an impressive therapeutic result 〔J〕.Dermatol Ther,2013；26(1)：77-8.

6Ghasri P，Yentzer BA，Dabade TS，etal.Acitretin for the treatment of psoriasis：an assessment of national trends 〔J〕.J Drugs Dermatol,2011；10(8)：873-7.

7史玉玲，顾俊瑛，徐晓光，等.阿维A对重度斑块状银屑病患者Th17细胞相关因子的影响〔J〕.中国皮肤性病学杂志，2011；25(1)：21-3.

8赵 婧，谢 勇.阿维A对寻常性银屑病患者外周血MCP-1及MIP-1α表达水平的影响〔J〕.中国皮肤性病学杂志，2012；26(11)：971-3.

9Wu L，Liu YJ.Development of dendritic cell lineages〔J〕.Immunity，2007；26(6)：741-50.

10Liu YJ，Blom B.Th2-inducing DC2 for immunotherapy 〔J〕.Blood，2000；95(8)：2482-3.