Cajal间质细胞在胃癌胃肠动力障碍中作用的实验研究

胡俊华，王 琦，卢光新，杨艳果

湖北医药学院附属人民医院消化内科，湖北 十堰 442000

胃癌是世界最常见的恶性肿瘤之一，发病率居第2位，死亡率仍居各种恶性肿瘤之首，每年约有934000例新发病例，其中约42%在中国［1］。临床上发现大部分被诊断为胃癌的患者均有餐后上腹饱胀不适、间断性上腹痛、反酸、嗳气、恶心、呕吐等消化道梗阻症状，但影像学检查未发现肠道梗阻的证据，仅提示胃肠动力下降。这些症状仅用肿瘤的发展不能完全解释。

胃肠 Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是分布在胃肠道内由中胚层间充质细胞分化而来的一类细胞，被证实是胃肠道平滑肌的起搏细胞，以细胞网的形式分布于整个胃肠道，产生自发性电慢波，参与神经信号传递，调控胃肠道平滑肌的舒缩和蠕动，在胃肠道动力产生和传导中具有重要作用［2］。大量实验研究发现，ICC的减少及分布异常与人类很多胃肠动力障碍有关［3］。本研究通过胃癌大鼠模型，观察胃癌大鼠幽门环形肌和下食管括约肌(lower esophageal sphincter，LES)肌条收缩功能的变化，ICC在胃体和胃窦变化，探索ICC与胃癌胃肠动力障碍的关系。

1 材料与方法

1.1 动物分组 裸鼠20只(湖北省实验动物研究中心提供)2个月龄，雌雄不拘，体质量16～20 g，随机分为正常对照组、胃癌组，每组10只。

1.2 细胞株及细胞培养 人胃低分化腺癌细胞株SGC-7901，来自湖北医药学院附属人民医院中心实验室。SGC-7901细胞吸尽上清液，PBS液洗涤2次，加入0.25%胰蛋白酶溶液0.5 ml，放置37℃恒温水浴箱中5 min，振荡后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，摇匀后分瓶，放入5%CO2细胞培养箱中孵育。倒置显微镜下观察细胞贴壁生长情况，长满瓶底后如上法分瓶孵育，直至所需的细胞数。取清洁血球计数板、盖玻片，用0.4%台盼蓝染液与细胞悬液混匀，从盖玻片一侧计数板凹槽加入，于低倍倒置显微镜下观察计数四角大分格中的细胞数。

1.3 动物模型的制作 将人胃癌SGC-7901细胞用0.2%胰酶消化成细胞悬液，无血清RPMI-1640培养基调整细胞浓度至1.0×106个/ml，台盼蓝染色记数活细胞＞95%。用1.0 ml微量注射器将0.2 ml细胞悬液皮下接种于胃癌组裸鼠右侧背部，每只接种0.2 ml。当接种部位肿瘤长至最大径4～5 mm时确定造模成功。

1.4 胃肌条张力变化 实验时迅速敲击裸鼠头部致晕，剖腹取胃，沿胃小弯剪开胃腔，冲洗胃腔。切取幽门环形肌和下食管括约肌肌条各一条(长10 mm，宽2 mm)，置于盛有Krebs液的平皿中，仔细剥离黏膜层后，在Krebs液(37℃)的肌槽中恒温孵育，肌槽底部持续通入95%O2和5%CO2的混合气体。肌条一端用1号丝线固定在肌槽底部的有机玻璃弯钩上，另一端固定在连于多导生理记录仪的张力传感器上，肌条与张力换能器相连，温育1 h，给张力换能器1 g的前负荷。张力换能器输入生理记录仪，记录肌条的机械收缩运动。

1.5 ICC的检测 处死裸鼠，分离胃体组织，置10%中性甲醛固定，常规石蜡固定并切片。经恒温箱60℃烘烤脱蜡和常规水化，经0.01 mol/L枸橼酸缓冲液pH(6.0 ±0.1)微波热修复，PBS 洗 5 min，5%牛血清白蛋白室温封闭20 min，加入一抗c-kit抗体(兔IgG)37℃温育1 h，PBS洗3次，5 min/次，加入酶标记二抗(HRP标记的羊抗兔IgG)，37℃ 30 min，DAB显色试剂盒显色。每张切片光镜下(400×)随机选10个视野，计数棕黄色的梭形、多角形和不规则形细胞数目，每张切片测量3次，取均值，进行统计学处理。

1.6 统计学分析 应用SPSS 13.0软件包进行分析和处理数据，所有数据均采用均数±标准差表示，同组用药前后电活动的比较采用配对t检验，组间比较采用单因素方差分析(sNK法)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 裸鼠离体幽门环形肌条及LES肌条收缩功能的测定 给张力换能器1 g的前负荷，幽门环形肌机械收缩运动记录结果显示，胃癌组幽门环形肌条及LES肌条肌肉张力和收缩振幅明显降低，差异有统计学意义(P ＜0.01，见表1)。

表1 裸鼠离体幽门环形肌条及LES肌条的运动测定()Tab 1 The motility of pylorus muscles and lower esophageal sphincter muscle on nude mice()

表1 裸鼠离体幽门环形肌条及LES肌条的运动测定()Tab 1 The motility of pylorus muscles and lower esophageal sphincter muscle on nude mice()

注:与正常对照组比较，*P ＜0.01。

2.2 裸鼠胃体ICC的变化 免疫组化染色显示正常对照组胃窦和胃体部Kit阳性细胞(棕黄色颗粒)密集地分布在环形肌层和纵形肌层之间，主要是在环形肌层内及其附近，肌间神经丛中也有密集的ICC分布，胃底肌间神经丛未见ICC分布。胃癌组Kit阳性细胞非常稀疏地分布在环形、纵形肌层间，而且无环形肌层内及附近主要分布的特点，分布密度明显低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。胃癌组数目与正常对照组相比明显减少，且形态异常，突起减少，并变短、变钝。

表2 两组ICC免疫组化半定量测定 ()Tab 2 Immunohistochemistry results of interstitial cells of Cajal(ICC)()

表2 两组ICC免疫组化半定量测定 ()Tab 2 Immunohistochemistry results of interstitial cells of Cajal(ICC)()

注:与正常对照组相比，*P ＜0.01。

分组 例数 胃体 胃窦正常对照组10 33.46 ±3.12 21.23 ±3.21胃癌组 10 7.68 ±2.15* 12.23 ±3.54*

图1 裸鼠胃体ICC的c-kit免疫组织化学染色(60×)A:正常对照组;B:胃癌组Fig 1 c-kit immunohistochemistry staining of ICC in nude mice(60×) A:nomal control group;B:gastric cancer group

3 讨论

ICC是胃肠道平滑肌的起搏细胞，以细胞网的形式分布于整个胃肠道，产生自发性电慢波、参与神经信号传递，调控胃肠道平滑肌的舒缩和蠕动［4］。研究发现先天性巨结肠患儿病变段结肠壁内三种亚型的ICC数量均明显减少甚至缺失，病变肠管丧失产生电慢波的能力，同时也有神经节细胞的减少共同导致了胃肠道动力紊乱。此外，还有很多消化道功能障碍性疾病也都存在ICC缺乏或减少，如慢性假性梗阻、贲门失迟缓症、幽门狭窄、结肠蠕动缓慢、肛门括约肌失弛缓症、输入肠管症候群、糖尿病肠功能障碍、慢传输型便秘及部分性肠梗阻、手术肠切除、空肠炎等均会引起ICC网络紊乱和胃肠运动异常。因此，ICC的分布异常及功能缺失是很多胃肠功能紊乱的病理、生理学基础。临床上大多数胃癌患者均表现为上腹部疼痛外，可伴有反酸、烧心、嗳气、恶心、呕吐等消化道梗阻症状。因此，我们推测ICC在胃癌胃肠动力紊乱病理、生理机制中起着一定作用。

本实验结果提示，胃癌组离体幽门环形肌条及LES肌条机械收缩波的振幅和频率都较正常组明显减少，表明发生胃肠动力障碍的胃癌大鼠胃机械收缩活动比正常对照组减弱，与我们临床观察到的患者早饱、恶心呕吐、胃潴留等胃排空减弱的现象一致。

本研究中，组织切片c-kit免疫组化染色显示，胃癌模型组大鼠胃体的ICC数目明显减少，细胞突触减少。它的减少可导致胃肠神经系统与平滑肌间的信息传递障碍，从而导致平滑肌收缩能力下降;ICC数目明显减少，更会影响胃慢波的产生，使胃电节律紊乱，引起食管、胃蠕动缓慢，动力障碍。由此可见，胃癌ICC的异常改变与出现胃肠运动功能障碍有密切联系。

总而言之，胃癌患者出现胃肠运动功能障碍，ICC的异常改变是其重要原因之一。保持ICC的数量和功能，延迟ICC信号网络的破坏将有助于提高胃癌患者的生存质量。对ICC的研究将有助于找到一种辅助疗法，值得进一步研究。

［1］Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al.Global cancer statistics，2002［J］.CA Cancer J Clin，2005，55(2):74-108.

［2］Takaki M.Gut pacemaker cells:the interstitial cells of Cajal(ICC)［J］.J Smooth Muscle Res，2003，39(5):137-161.

［3］Wang XY，Huizinga JD，Diamond J，et al.Loss of intramuscular and submuscular interstitial cells of Cajal and associated enteric nerves is related to decreased gastric emptying in streptozotocin-induced diabetes［J］.Neurogastroenterol Motil，2009，21(10):1095-e92.

［4］Ward SM，Sanders KM.Interstitial cells of Cajal:primary targets of enteric motor innervation［J］.Anat Rec，2001，262(1):125-135.