S-腺苷蛋氨酸对活化人肝星状细胞增殖和凋亡的影响*

张 峰 诸葛宇征 顾建祥 李昱江

南京大学医学院附属鼓楼医院消化内科(210008)

肝纤维化是各种慢性肝病所致的一种创伤愈合反应，其特点是肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)活化导致细胞外基质大量沉积[1]。HSCs的活化是肝纤维化发生的中心环节，因此抑制HSCs活化表型是肝纤维化治疗的重要策略。S-腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)是机体最重要的甲基供体，亦是临床上常用的保肝退黄药物，近年研究表明SAM具有一定的抗纤维化作用[2]，SAM能抑制HSCs的增殖，并可通过抑制HSCs的某些信号通路而阻止其活化[3-4]，但目前尚不能完全阐释SAM对活化HSCs的影响及其抗纤维化机制。本研究通过探讨SAM对活化人肝星状细胞株LX-2细胞增殖、细胞周期、凋亡以及α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin, SMA)的影响，以期为进一步研究SAM的抗纤维化作用机制奠定基础。

材料与方法

一、细胞株、主要试剂

人肝星状细胞株LX-2购于博慧斯生物医药科技有限公司，为人HSCs转染SV40后经低浓度血清筛选得到的细胞株。

SAM购自雅培中国，应用含10%胎牛血清的DMEM培养基配制成浓度为10 mmol/L的母液，以0.22 μm微孔滤器过滤，调节pH值至7.4，4 ℃保存备用，保存时间不超过6 h。DMEM高糖培养基、青霉素和链霉素购自美国Gibco公司；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶购自美国Hyclone公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒、Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂购自南京凯基生物科技发展有限公司；PI/RNase染色缓冲液、ECL试剂盒购自美国BD公司；实时定量PCR试剂盒、Trizol试剂购自日本Takara公司；鼠抗人α-SMA抗体、山羊抗鼠IgG、GAPDH抗体购自美国Abcam公司。

二、实验方法

1. 细胞培养：LX-2细胞株采用DMEM培养基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。0.25%胰酶消化传代，取对数生长期的细胞用于后续实验。

2. CCK-8实验：取对数生长期细胞，以100 μL/孔接种于96孔培养板，细胞浓度约5×104/mL，常规培养24 h后细胞贴壁良好，弃上清，改用含不同浓度SAM(0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mmol/L)的培养基，每个浓度设6个复孔。继续培养24 h后轻轻吸去上清液，含胎牛血清培养基100 μL/孔漂洗1次，加入已混匀的含CCK-8的培养基(培养基与CCK-8体积之比为9∶1)100 μL/孔，继续培养1 h后，上酶标仪检测波长为450 nm处的吸光度(A)值。6个复孔的结果去掉最大和最小A值，计算生长抑制率。抑制率(%)=(A对照组-A药物组)/A对照组×100%，并绘制增殖抑制曲线。

3. 流式细胞术：①细胞周期：取对数生长期细胞，加入含不同浓度SAM(0、1.0、2.0、4.0 mmol/L)的培养基，常规培养24 h。采用不含EDTA的胰酶消化，收集约1×106个细胞，离心弃上清，PBS漂洗1次；加入-20 ℃预冷的70%乙醇重悬，4 ℃固定至少24 h；离心弃固定液；PBS漂洗2次，加500 μL PI/RNase缓冲液重悬，室温避光15 min，上机检测细胞周期。②细胞凋亡：取对数生长期细胞，加入含不同浓度SAM(0、1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L)的培养基，胰酶消化、收集1×105～5×105个细胞；加入500 μL Binding Buffer悬浮细胞；先后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混匀；室温避光反应5～15 min；上机检测。

4. 实时定量PCR法检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1) mRNA表达：取对数生长期细胞，加入含不同浓度SAM(0、1.0、2.0、4.0 mmol/L)培养基，常规培养24 h。采用Trizol试剂提取LX-2细胞总RNA并合成cDNA模板。PCR引物由日本Takara公司设计合成，cyclin D1上游：5’-ATG TTC GTG GCC TCT AAG ATG A-3’，下游：5’-CAG GTT CCA CTT GAG CTT GTT C-3’；以GAPDH为内参，上游：5’-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3’，下游：5’-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3’。使用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒行PCR，以2-△△Ct法计算目的基因的表达，上ABI 7500 Biosystem行结果分析。

5. 蛋白质印迹法检测α-SMA蛋白表达：取对数生长期细胞，加入含不同浓度SAM(0、1.0、2.0、4.0 mmol/L)的培养基，常规培养24 h。采用细胞裂解液裂解细胞，BCA法蛋白量，行常规SDS-PAGE电泳。5%脱脂奶粉封闭转印膜。加入抗α-SMA单克隆抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体(1∶2 500)室温孵育1 h，最后ECL发光液显影。

三、统计学分析

结 果

一、SAM抑制LX-2细胞增殖

CCK-8实验结果显示，随着SAM浓度增加，LX-2细胞增殖抑制率逐渐升高；与对照组相比，3.0～8.0 mmol/L SAM组细胞增殖抑制率明显升高(P<0.05)，而1.0、2.0 mmol/L组无明显差异(P>0.05)(见图1)。说明在一定浓度范围内，SAM能抑制LX-2细胞的增殖，并呈剂量依赖效应。

图1 SAM对LX-2细胞增殖的影响

二、SAM阻滞LX-2细胞周期于S期

流式细胞术结果显示，随着SAM浓度的增加，G1/G0期细胞比例逐渐下降(F=20.149，P<0.001)，S期细胞比例逐渐升高(F=17.979，P=0.001)，G2/M期细胞比例无明确变化趋势。与对照组相比，1.0 mmol/L组G1/G0、S、G2/M期细胞比例均无明显差异(P>0.05)；2.0、4.0 mmol/L组G1/G0期细胞比例显著降低(P<0.05)，S期细胞比例显著升高(P<0.05)，G2/M期细胞比例无明显差异(见表1)。说明SAM可使LX-2细胞周期阻滞于S期。

表1 各组细胞周期分布情况

*与对照组比较，P<0.05

三、SAM诱导LX-2细胞凋亡

流式细胞术结果显示，SAM能诱导LX-2 细胞凋亡，并呈剂量依赖效应。与对照组相比，1.0、2.0 mmol/L组的细胞早期、晚期和总体凋亡率均无明显差异(P>0.05)；4.0、8.0 mmol/L组的早期凋亡率显著升高(27.3%、36.8%对7.0%，P<0.05)，总体凋亡率亦显著升高(33.3%、44.5%对9.9%，P<0.05)，而晚期凋亡率无明显差异(见图2)。

四、SAM 增强cyclin D1 mRNA表达

实时定量PCR法结果显示，不同浓度SAM组cyclin D1 mRNA表达较对照组呈逐渐增高的趋势，其中2.0、4.0 mmol/L组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

五、SAM降低α-SMA蛋白表达

蛋白质印迹法结果显示，1.0、2.0、4.0 mmol/L SMA组细胞内纤维化标记物α-SMA蛋白表达均显著低于对照组(P<0.05)(见表2、图3)。

*与对照组比较，P<0.05

表2 各组cyclin D1 mRNA表达和α-SMA蛋白表达情况

*与对照组比较，P<0.05

1 Da=0.9921 u

讨 论

静息HSCs转化为活化HSCs表型是肝纤维化发生的重要环节，而活化HSCs转化为静息HSCs表型是肝纤维化逆转的关键。因此，抑制甚至逆转活化HSCs是肝纤维化的潜在治疗策略。目前，抑制HSCs活化和抗纤维化的药物层出不穷，但绝大多数仍处于动物实验阶段，尚缺乏能广泛用于临床且疗效显著的药物[5]。

SAM为一种临床应用多年的保肝降黄药物。近年研究发现，体外原代培养的HSCs在自动活化过程中细胞内SAM水平下降，DNA甲基化水平降低，进而促进HSCs活化[6]。同时，有研究表明SAM能调节原代培养HSCs的激活、增殖和收缩能力[3]，抑制HSCs的活化[7]，在肝纤维化的逆转中起一定作用。SAM抗纤维化的相关作用机制的研究发现，SAM可能通过抑制H2O2介导的信号通路而抑制基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-1产生以及胶原沉积[4,8]；Oliva等[9]发现SAM亦可能通过抑制Toll样受体的上调而发挥抗纤维化作用。但SAM对活化HSCs的作用尚无足够研究证据。国内刘梅等[10]的研究表明SAM能显著抑制活化HSCs的增殖，但目前尚无研究探讨其机制。本研究以活化的人肝星状细胞株LX-2作为研究对象，旨在探讨SAM对HSCs增殖、细胞周期和凋亡等的影响。

本实验参照相关研究[3-4]设置SAM溶液浓度，并由预实验验证。结果显示，在一定浓度范围内(3.0～8.0 mmol/L)，SAM能有效抑制LX-2细胞增殖，并呈剂量依赖效应，与Matsui等[3]的研究结果相符。为进一步探讨其作用机制，检测细胞周期发现2.0、4.0 mmol/L SAM将LX-2细胞周期阻滞于S期，上调cyclin D1表达。推测SAM通过上调cyclin D1表达使LX-2细胞周期阻滞于S期，从而发挥抑制细胞增殖的作用。流式细胞术检测发现，4.0、8.0 mmol/L SAM能明显诱导LX-2细胞凋亡；但晚期凋亡率无明显差异，这可能是由于SAM处理时间较短所致。在非毒性浓度下(1.0、2.0 mmol/L SAM组细胞增殖和凋亡率与对照组无明显差异)，SAM即可明显抑制活化HSCs的标志性分子α-SMA的蛋白表达，进一步证实SAM能抑制活化HSCs。

综上所述，SAM能抑制LX-2细胞增殖，其机制可能为通过上调cyclin D1表达使LX-2细胞周期阻滞于S期；同时，SAM能诱导LX-2细胞凋亡，下调α-SMA表达；提示SAM能通过影响HSCs的生物学行为而起抗纤维化作用，为进一步探讨SAM对HSCs的机制及其抗纤维化作用奠定一定分子基础。

1 Friedman SL. Mechanisms of hepatic fibrogenesis[J]. Gastroenterology, 2008, 134 (6): 1655-1669.

2 Nieto N, Cederbaum AI. S-adenosylmethionine blocks collagen Ⅰ production by preventing transforming growth factor-beta induction of the COL1A2 promoter[J]. J Biol Chem, 2005, 280 (35): 30963-30974.

3 Matsui H, Kawada N. Effect of S-adenosyl-L-methionine on the activation, proliferation and contraction of hepatic stellate cells[J]. Eur J Pharmacol, 2005, 509 (1): 31-36.

4 Cao Q, Mak KM, Lieber CS. DLPC and SAMe combined prevent leptin-stimulated TIMP-1 production in LX-2 human hepatic stellate cells by inhibiting HO-mediated signal transduction[J]. Liver Int, 2006, 26 (2): 221-231.

5 吴盛迪, 王吉耀. 抗肝纤维化治疗研究进展[J]. 肝脏, 2009, 14 (1): 71-73.

6 Ramani K, Yang H, Kuhlenkamp J, et al. Changes in the expression of methionine adenosyltransferase genes and S-adenosylmethionine homeostasis during hepatic stellate cell activation[J]. Hepatology, 2010, 51 (3): 986-995.

7 Karaa A, Thompson KJ, McKillop IH, et al. S-adenosyl-L-methionine attenuates oxidative stress and hepatic stellate cell activation in an ethanol-LPS-induced fibrotic rat model[J]. Shock, 2008, 30 (2): 197-205.

8 Thompson KJ, Lakner AM, Cross BW, et al. S-adenosyl-L-methionine inhibits collagen secretion in hepatic stellate cells via increased ubiquitination[J]. Liver Int, 2011, 31 (6): 891-901.

9 Oliva J, Bardag-Gorce F, Li J, et al. S-adenosylmethionine prevents the up regulation of Toll-like receptor (TLR) signaling caused by chronic ethanol feeding in rats[J]. Exp Mol Pathol, 2011, 90 (3): 239-243.

10 刘梅, 陆伦根, 窦爱霞, 等. S-腺苷蛋氨酸对人肝星状细胞增殖和氧应激及转化生长因子β1表达的影响[J]. 肝脏, 2007, 12 (2): 99-102.