贯叶金丝桃药材HPLC指纹图谱研究

传娟娟

（延安市食品药品检验所，陕西 延安716000）

贯叶金丝桃为藤黄科金丝桃属多年生草本植物Hypreicum perforatum L.的干燥地上部分［1］。该属植物分布广泛，全世界共400余种，中国有55种、8个亚种，主要分布在西北、西南等地区［2］。生长于山坡、草丛、田埂、路边。具有舒肝解郁、清热利湿、消肿止痛之功效，用于情志不畅、气滞郁闷、关节肿痛、小便不利等，还具有抗抑郁、抗肿瘤及抗病毒的特性。随着对其在抗抑郁、抗肿瘤和艾滋病治疗等方面研究的深入，贯叶金丝桃提取物越来越受到人类重视，它是近年来欧美最畅销的植物药之一，1997年被世界卫生组织评定“植物药之星”。在德国，贯叶金丝桃的研究和应用处在世界前列，由贯叶金丝桃单味药组成的植物药已成为治疗中、轻度抑郁症的主导药物［3］。贯叶金丝桃中主要含有贯叶金丝桃素、金丝桃素、金丝桃苷、槲皮素、异槲皮素、槲皮甙、芦丁等多种成分［4-5］。本实验采用高效液相色谱法建立贯叶金丝桃的指纹图谱分析方法，为科学控制贯叶金丝桃质量提供参考。

1 仪器与试药

Waters高效液相系统（Waters 1525泵，Waters 2487 DualλAbsorbance Detector）；Waters Empower色谱工作站；KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BS224S电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。

金丝桃苷对照品（批号：111521-200303，中国药品生物制品检定所）；贯叶金丝桃药材，经西北农林科技大学生命科学学院陈彦生研究员鉴定为贯叶金丝桃，样品来源见表1。乙腈、甲醇（色谱纯，TEDIA），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

表1 样品来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Diamonsil®C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色谱柱；流动相：乙腈（含10%甲醇和0.2%甲酸）-水（含20%甲醇和0.2%甲酸）梯度洗脱，0～5 min时乙腈10%，5～15 min时乙腈10%→40%；15～40 min时乙腈40%→90%；40～50 min时乙腈90%→100%；50～65 min时乙腈100%；65～66 min时乙腈100%→10%；记录时间为66 min；检测波长为270 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为室温；进样体积20μL。

2.2 对照品溶液制备及标准曲线的绘制

精密称取金丝桃苷对照品2.4 mg，置于10 mL量瓶中，加色谱甲醇超声溶解并定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液作为金丝桃苷对照品溶液。

精密吸取金丝桃苷对照品溶液稀释成不同浓度，各取20μL注入高效液相色谱仪测定。以峰面积值为纵坐标Y，以金丝桃苷浓度（μg/mL）为横坐标X，绘制标准曲线见图1），计算得线性方程：Y金丝桃苷=64963X+911082，r=0.9996，金丝桃苷进样浓度在24.0～240.0μg/mL范围内呈良好的线性关系。

图1 金丝桃苷HPLC标准曲线

2.3 供试品溶液的制备

取14批不同产地的贯叶金丝桃药材，粉碎过60目筛，精密称取粉末2.0 g，加入80 mL丙酮超声辅助提取3次，每次40 min，超声功率200 W，将所得提取液过滤并旋转蒸发至干，用色谱甲醇洗涤定容至10 mL的棕色容量瓶，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液即为供试品溶液。

2.4 稳定性试验

取同一批供试品溶液，在相同的条件下分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析，其色谱峰的相对保留时间和峰面积的RSD均在5%以内，符合指纹图谱的要求。

2.5 精密度试验

取同一供试品溶液，在相同条件下分别进样6次，其色谱峰的相对保留时间和峰面积的RSD均在5%以内，符合指纹图谱的要求。

2.6 重现性试验

取同一批样品，在相同条件下分别称取5份，制备供试品溶液，进样，记录结果，其色谱峰的相对保留时间和峰面积的RSD均在5%以内，符合指纹图谱的要求。

2.7 指纹图谱的建立

精密吸取供试品溶液20μL，进样，将获得的14批贯叶金丝桃药材的色谱数据导入国家药典委员会2004年颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》，选用1号对照药材的色谱图作为参照图谱，以中位数法作为对照指纹图谱的生成方法，设定时间窗宽度为0.90 min，采用多点校正方法进行色谱峰的自动匹配，以3号峰作为参照峰（S）生成贯叶金丝桃的HPLC指纹图谱13个共有峰。经证实2号峰为芦丁，3号峰为金丝桃苷，7号峰为槲皮素，样品指纹图谱叠加图（见图2）。并形成药材的对照指纹图谱（见图3）。经手动匹配用《EXCEL》2002软件系统［6］，采用夹角余弦法（均值）计算的14批贯叶金丝桃药材HPLC指纹图谱与对照指纹图谱（14批贯叶金丝桃药材指纹图谱形成的）相似度（见表2）。

图2 贯叶金丝桃药材指纹图谱叠加图

图3 贯叶金丝桃药材HPLC对照指纹图谱

表2 贯叶金丝桃药材HPLC指纹图谱相似度计算结果

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法的考察

考察了超声提取、回流提取、索氏提取3种提取方式，其中索氏提取的效果很差，而超声提取和回流提取色谱图峰强度和峰数相近。用不同浓度的甲醇、乙醇、丙酮为提取溶剂，分别进行超声提取和回流提取，其丙酮超声提取的色谱峰数目较多，而且色谱图整体效果不错，故选取丙酮超声为供试品溶液的制备方法。

3.2 色谱条件的选择

本实验所用高效液相色谱条件是在参考有关文献的基础上［7-8］经过多次优化、筛选而确定的。曾参考张俊松［9］选用的甲醇-0.006 mol/L磷酸氢二钠缓冲盐（用磷酸调节pH至6.5）梯度洗脱效果不理想；又参考郑清明所用的流动相A相为80%水-19%乙腈-1%磷酸，B相为59%乙腈-40%甲醇-1%磷酸梯度洗脱，仍达不到分离的效果；后来则参考Wenkui Li［10］将其中的0.5%三氟乙酸，分别用0.5%甲酸、0.1%冰醋酸、以及0.2%甲酸来替换，结果表明0.2%甲酸的分离效果较好，所以选定流动想的配比为乙腈（含10%甲醇和0.2%甲酸）、水（含20%甲醇和0.2%甲酸）梯度洗脱，并在254 nm、270 nm、360 nm、590 nm不同的检测波长下生成色谱图，结果为590 nm下的峰数很少，而且峰高很低，360 nm下的基线比较平稳，峰的分离效果也很好，但是和270 nm下相比峰数较少，254 nm下的基线漂移十分严重，而且峰的数目和高度几乎和270 nm下一样，综合考虑270 nm下的基线相对比较平稳，而且峰的数目和峰的高度都相对理想，而且分离效果也很好，故选择检测波长为270 nm。对梯度洗脱的比例时间进行摸索研究选出了最优的洗脱程序。考察流速时发现流速为0.6 mL/min于流速为1.0 mL/min对峰的分离效果几乎没有什么变化，且流速为0.6 mL/min时，出峰时间延后，洗脱时间延长，故选用流速为1.0 mL/min。

3.3 贯叶金丝桃指纹图谱与地域的关系

本实验所用贯叶金丝桃药材主要采自于陕西、四川、甘肃、安徽4省。结果表明，不同产地的贯叶金丝桃药材色谱图中各共有峰相对保留时间对应得非常好，但共有峰相对峰面积差别较大，有的产地的药材甚至缺失某些峰，这可能与药材的产地土壤条件、种植方法以及采集时间等因素有关。其中13号样品的相似度较差，可能是因为此样品植株从海拔两千多米的高山草甸移栽至平原地生长，由于生长环境的变化造成化学成分及次生代谢产物发生变化。移栽后贯叶金丝桃的生长形态也有所变化，由原来的草本直立生长变为匍匐枝生长，没有出现茎的分化。这表明，贯叶金丝桃中各成分的量与产地及海拔有密切关系。其中四川及甘肃陇西的药材质量较优，可作为道地药材。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：化学工业出版社，2010：215.

［2］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］.北京：科学出版社，1990：21.

［3］王泽剑.圣约翰草提取物的临床研究［J］.国外医学精神病学分册，2003，30（4）211-213.

［4］吴英，李萍，周素娣.贯叶金丝桃素黄酮醇类成分研究［J］.中草药，2001，32（3）206.

［5］Felicia B.Williams，Lane C.Sander，Stephen A.Wise.Development and evaluation of methods for determination of naphthodianthrones and flavonoids in St.John's wort［J］.Journal of Chromatography A，2006，1115：93-102.

［6］苗爱东，孙殿甲.Excel 2002在中药指纹谱相似度计算中的应用［J］.药学进展，2003，27（1）：51-54.

［7］郑清明，秦路平，郑汉臣等.金丝桃属植物的HPLC指纹图谱研究［J］.中草药，2003，34（4）：365-370.

［8］Wenkui Li，John F.Fitzloff.High performance liquid chromatographic analysis of St.John's Wort with photodiode array detection［J］.Journal of Chromatography B，2001（765）：99-105.

［9］张俊松，王晓利，罗谦等.贯叶连翘的HPLC指纹图谱［J］.华西药学杂志，2006，21（5）：440-442.

［10］Wenkui Li，John F.Fitzloff.High performance liquid chromatographic analysis of St.John's Wort with photodiode array detection［J］.Journal of Chromatography B，2001（765）：99-105.