槲皮素对前列腺癌细胞热休克蛋白27表达的影响

于 峰，姜丽丽，邸彦橙

牡丹江医学院红旗医院泌尿外科，黑龙江牡丹江157011

热休克蛋白 (heat shock protein，HSP)作为分子伴侣广泛存在于原核与真核细胞体内，可参与细胞凋亡、细胞周期的调控以及细胞信号传导等重要的生物学过程，是生物体内具有广泛和重要生物学功能的蛋白质［1］。HSP27是HSP亚家族成员之一，在多种肿瘤细胞中均有过表达，其主要生物学功能是防止各种应激因素对细胞的损伤，HSP27还与调节细胞增殖、分化及细胞凋亡的信号转导等有关［2］。前列腺癌是男性中发病较高的肿瘤之一，有研究证实，黄酮、多酚类化合物是预防治疗前列腺癌很有潜力的药物。目前，HSP27与肿瘤的关系日益受到重视，但有关HSP27在前列腺癌发生发展及预后中所起作用的报道较少。槲皮素是一种黄酮类化合物，在自然界中广泛存在，除具有多种生物学活性外，还可通过多种机制抑制肿瘤细胞增殖、诱导分化和凋亡等，发挥抗肿瘤活性［3］。本研究观察了HSP27在不同恶性程度前列腺癌细胞株RWPE-1、LNCaP、PC-3和TSU-Pr1中的表达情况，分析了槲皮素对PC-3细胞株HSP27表达的影响。

材料和方法

材料槲皮素购自美国Sigma公司，使用二甲基亚砜 (dimethyl sulfoxide，DMSO)分别配制成0.3 mg/ml(半数有效量［4］)和0.6 mg/ml溶液，置于 -20℃冰箱保存备用。人前列腺癌细胞株RWPE-1、LNCaP、PC-3和TSU-Pr1购自上海艾研生物科技有限公司。所有细胞株分别分为空白对照组、阴性对照组、槲皮素高剂量组 (给予0.6 mg/ml槲皮素150 μl)和槲皮素低剂量组 (给予0.3 mg/ml槲皮素150 μl)4组。

细胞培养RWPE-1、LNCaP、PC-3和TSU-Pr1细胞分别保存于含有10%胎牛血清的F12营养培养基(含青霉素100 U/ml和链霉素100 μg/ml)，以1×106个细胞/孔的密度接种于6孔板中，37℃、5%CO2及饱和湿度下培养24 h。实验每一个步骤至少重复4次。

槲皮素治疗待80%细胞融合后，更换新鲜培养液，加入不同浓度槲皮素，空白对照组不给药，阴性对照组给予等体积DMSO。

免疫荧光染色常规方法收获细胞，胰蛋白酶消化贴壁细胞，PBS冲洗后，TCM-N3冲洗，50 ml锥形管2000 r/min(r=8.5 cm)离心10 min。将上清液吸出并重新悬浮于1 ml TCM-N3，滴于载玻片 (多聚赖氨酸包被)上吹干，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤5 min，共5次。滴加5 g/L BSA封闭液，37℃封闭30 min，加入相应的一抗，兔抗小鼠 HMGBl抗体(1∶200)，PBS洗涤5 min，共5次。加入荧光标记的二抗，PE标记的驴抗兔lgG(1∶500)，避光，37℃孵育2 h，PBS洗涤5 min，共5次。Hoechst 33342染料避光37℃孵育15 min，PBS洗涤，共3次。缓冲甘油封片，荧光显微镜观察、拍照并保存。

RT-PCR检测HSP27 mRNA的表达TRIzol试剂盒抽提总 RNA，溶于 20 μl DEPC-H2O，依次加入2.5 μl DNA 酶、2.5 μl 10 × buffer，37 ℃ 水浴 30 min后，65℃水浴10 min，分光光度法检测RNA浓度。HSP27 PCR引物:5’-AAGGAAATTCAAAATGCTGTCAA-3’(正向)和 5’-ACAGACAAGATCTCCCGGCACTT-3’(反向);GAPDH扩增产物:5’-GGTCAACGGGTAGGTGTTTG-3’(正向)和 5’-GCCTTTGGGCTCTGCATGAA-3’(反向)。HSP27 PCR反应总体积25 μl。采用Gene-Am P2400热循环仪，预变性94℃5 min;变性94℃30 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃30 s，共35个循环;最后72℃延伸5 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳 (110V，35 mA，30 min)，溴化乙锭染色，BandScan 5.0软件进行电泳结果吸光度积分值分析，HSP27 mRNA表达相对含量值 (灰度比)=HSP27吸光度积分值/GAPDH吸光度积分值。

统计学处理采用SPSS17.0统计软件，所有数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

HSP27在各细胞株的表达情况免疫荧光染色结果显示，HSP27在各细胞株的染色强度，按照RWPE-1＜LNCaP＜PC-3＜TSU-Pr1顺序依次增强 (图1)。RT-PCR检测结果显示，RWPE-1、LNCaP、PC-3和TSU-Pr1细胞株HSP27 mRNA的表达水平分别为90%、100%、115%和148%(图2)。

槲皮素对HSP27 mRNA表达的影响空白对照组、阴性对照组、槲皮素高剂量组和槲皮素低剂量组PC-3细胞的HSP27 mRNA表达水平分别为128%、110%、50%、60%，其中，槲皮素高剂量组和槲皮素低剂量组的表达均明显低于空白对照组 (P均＜0.05)(图3)。

图1 各细胞株免疫荧光染色结果 (×400)Fig 1 Immunofluorescence staining results of different cell lines(×400)

图2 RT-PCR检测RWPE-1、LNCaP、PC-3和TSU-Pr1细胞株HSP27 mRNA的表达结果Fig 2 Expressions of HSP27 mRNA in the cell lines RWPE-1，LNCaP，PC-3，and TSU-Pr，as shown by RT-PCR

图3 槲皮素对HSP27 mRNA表达的影响Fig 3 Effect of quereetin on the HSP27 mRNA expression

讨 论

HSP是应激条件下产生的高度保守的分子伴侣［5］，是组织和器官受到刺激或应激时表达的主要蛋白质，可参与细胞损伤、防御、修护产生而控制细胞功能［6］。HSP的表达不仅抑制细胞损伤，而且对细胞的保护也起着重要作用，例如控制细胞凋亡和肿瘤免疫反应［7］。已知正常组织细胞内HSP27的表达水平很低，应激状态则可导致胞内HSP27磷酸化并造成其寡聚体解聚，HSP27表达上调。研究显示，HSP27在肿瘤发病中的作用与其对细胞的影响有关，它在细胞凋亡信号通路中可与相关活性蛋白相互作用并抑制凋亡信号的转导，从而抑制细胞凋亡，参与癌症发生，其在细胞凋亡时表达增加，并与肿瘤的恶性程度及预后有关［8-9］。HSP27可通过调节肿瘤细胞的增殖分化及细胞凋亡的信号转导，参与肿瘤的发生、侵袭以及转移过程［10］。Miyake 等［11］研究发现，HSP27、HSP70和HSP90可在前列腺癌细胞表达，但根据Gleason评分和病理分期，只有HSP27表达具有统计学意义，HSP27可作为前列腺癌预后判断的重要指标。Thomas等［12］研究显示，前列腺癌组织中不同细胞HSP27的着色强度有所不同，具有明显的异质性，HSP27的表达水平随着癌组织分化程度的增高而增高。本研究结果显示，HSP27的表达与前列腺癌细胞的分级呈正相关，即前列腺癌细胞分级越高，其表达水平也就越高，说明癌细胞的发生、发展、恶变、侵袭力等因素与HSP27的表达水平相关。

槲皮素是一种广泛存在于水果、蔬菜和中草药，如槐米、金荞麦、银杏叶等中的天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗肿瘤、抗血小板聚集、清除自由基和抗氧化等多种生物活性。方武等［4］研究证实，槲皮素可抑制白血病、结肠癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、膀肌癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞的生长和癌细胞DNA的生物合成，诱导肿瘤细胞发生凋亡。刘丽娜等［13］研究发现，HSP27在前列腺癌组中的表达阳性率高于前列腺上皮内瘤变组和前列腺增生组，且在前列腺上皮内瘤变组中的表达阳性率又高于前列腺增生组，提示随着前列腺病变的演变，HSP27的表达阳性率不断升高，并进一步推测，HSP27有可能参与了前列腺癌的演变过程。PC-3细胞来源于人前列腺癌上皮，具有低转移能力，是良好的实验选择细胞株［14］。本研究观察了槲皮素对前列腺癌PC-3细胞HSP27 mRNA表达的影响，结果显示，槲皮素可以抑制HSP27的表达，随着剂量增加，抑制作用增强，由此推测，槲皮素抑制HSP27的表达可能是其抗前列腺癌的机制之一。

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