初诊多发性骨髓瘤患者外周血淋巴细胞亚群的检测及意义

邹健 孙丽华 孟亚红 范小红 王雪莲 程韵枫,2

(1.复旦大学附属中山医院青浦分院血液科，上海 201700；2.复旦大学附属中山医院血液科，上海 200032)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种恶性单克隆浆细胞疾病，发病率位居血液系统恶性肿瘤的第2位[1]。近年来，新型靶向药物的应用使MM患者的预后有了一定程度的改善。研究[2-4]发现，MM患者可能因淋巴细胞表型和功能的异常，导致细胞免疫监视功能缺陷，免疫系统对恶变细胞的清除能力下降。本研究通过检测32例初诊MM患者外周血T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)比例以及血清中白蛋白(albumin，Alb)、β2微球蛋白(β2 microglobulin，β2-MG)的浓度，探讨MM患者的免疫功能状态及其与肿瘤负荷、病情进展、预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择复旦大学附属中山医院青浦分院血液科2011年1月—2013年7月收治的初诊MM患者32例，年龄46～80岁，中位年龄65岁；其中男性16例，女性16例；均符合MM诊断标准；按照国际分期系统(International Staging System，ISS)分期，32例中Ⅰ期4例、Ⅱ期12例、Ⅲ期16例。 选择健康献血者24例，其中男性14例，女性10例；年龄40～78岁，中位年龄64岁。所有研究对象采血时均无急慢性感染、其他肿瘤及自身免疫性疾病，且未行化疗。

1.2 方法 抽取研究对象清晨空腹静脉血4 mL，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。采用流式细胞术检测外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD19+淋巴细胞以及NK细胞、CD4+CD25+Treg细胞的比例。取外周血100 μL，置于流式检测管中，分别加入不同荧光标记的单克隆抗体各20 μL，4 ℃暗室孵育30 min后，每管加入本实验室配制的溶血素3000 μL，充分混匀后室温孵育12 min，1000 r/min离心5 min，弃上清液，加鞘液500 μL，应用美国BD公司生产的FACS Aria II Cell Sorter流式细胞仪检测，采用Cell quest软件分析数据。分别采用溴甲酚绿法、透射免疫比浊法检测患者血清Alb、β2-MG水平。

2 结 果

2.1 外周血淋巴细胞亚群比例的分析 与健康献血者相比，MM患者外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞比例的差异无统计学意义(P>0.05)，CD8+T淋巴细胞、NK细胞比例升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；CD4+/CD8+T淋巴比值、CD19+B淋巴细胞比例降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 初诊MM患者与健康献血者外周血淋巴细胞亚群的比例比较

2.2 MM患者外周血Treg细胞比例及其与临床分期、β2-MG、Alb的相关性分析 MM患者外周血CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞的比例[(6.56±1.98)%]较健康献血者[(4.35±1.35)%]明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；该比例随临床分期增加呈升高趋势，Ⅰ期为(5.32±0.32)%，Ⅱ期为(8.17±1.03)%，Ⅲ期为(9.64±2.01)%，差异有统计学意义(P<0.05)；且与β2-MG浓度呈正相关(P<0.05)，与Alb浓度无明显相关性(P>0.05)。

3 讨 论

MM是来源于B细胞的恶性浆细胞疾病。研究[3]发现，MM患者除了有体液免疫功能缺陷，其细胞免疫功能也有异常，尤其是T淋巴细胞的表型和功能异常。Goodyear等[5]研究发现，MM患者的CD4+T淋巴细胞表达受到抑制，而CD8+T淋巴细胞一般正常，导致CD4+/CD8+T淋巴细胞比值下降；CD4+/CD8+T淋巴细胞比值与疾病分期和治疗相关。本研究结果显示，与健康人比较，MM患者外周血淋巴细胞中CD8+、NK细胞比例升高；CD4+/CD8+T淋巴细胞比值、CD19+B淋巴细胞比例降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。因此，T细胞亚群的各种改变可能是MM患者原发免疫应答缺陷的原因之一，且影响预后。

CD4+CD25+Treg细胞是一群具有免疫负调控功能的T细胞亚群，在维持对自身成分免疫耐受的同时，也可阻止机体对自身同源肿瘤细胞的免疫，导致肿瘤的免疫抑制及免疫逃逸。Feyler等[2]研究发现，MM患者外周血Treg细胞比例增加，且与疾病严重程度呈正相关。本研究结果显示，MM患者外周血CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞的比例明显升高，与Feyler等[2]的研究相符。但是，也有研究[6]发现，MM患者CD4+CD25+Treg细胞存在功能缺陷。Treg细胞在MM中的具体作用尚需进一步研究。

ISS分期是一种与MM预后相关的分期系统。MM患者的β2-MG水平与肿瘤负荷及预后有关。本研究显示，MM患者外周血CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞的比例在疾病各期均高于健康献血者，并与临床分期呈正相关，其与β2-MG浓度也呈正相关(P<0.05)，提示CD4+CD25+Treg细胞比例，与MM肿瘤负荷、病情预后相关，是预后不良的影响因素。也有研究[7]显示，CD4+CD25+Treg细胞还能反映疾病的活动程度。

综上所述，本研究初步分析了MM患者外周血中淋巴细胞亚群的水平，结果提示，T细胞亚群异常是MM患者原发免疫应答缺陷的原因之一；MM患者CD4+CD25+Treg细胞比例异常升高，提示Treg细胞在免疫抑制中发挥作用，导致MM免疫逃逸，并同肿瘤负荷、病情进展、预后有关。此结论有待于扩大样本量进一步深入验证。

[1]郭秀臣,全丽娜,李红,等.多发性骨髓瘤患者骨髓中Treg细胞与预后相关性研究[J].实用肿瘤学杂志,2014,28(1):54-58.

[2]Feyler S,Scott GB,Parrish C,et al.Tumour cell generation of inducible regulatory T-cells in multiple myeloma is contact-dependent and antigen-presenting cell-independent[J]. PLoS One,2012,7(5):e35981.

[3]Shen CJ,Yuan ZH,Liu YX,et al.Increased numbers of T helper 17 cells and the correlation with clinicopathological characteristics in multiple myeloma[J].J Int Med Res,2012,40(2):556-564.

[4]Giannopoulos K,Kaminska W,Hus I,et al.The frequency of T regulatory cells modulates the survival of multiple myeloma patients:detailed characterisation of immune status inmultiple myeloma[J].Br J Cancer,2012,106(3):546-552.

[5]Goodyear OC,Pratt G,McLarnon A,et al.Differential pattern of CD4+and CD8+T-cell immunity to MAGE-A1/A2/A3 in patients with monoclonal gammopathy of undermined significance(MGUS) and multiple myeloma[J]. Blood,2008,112(8):3362-3372.

[6]Feyler S,von Lilienfeld-Toal M,Jarmin S,et al.CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells are increased whilst CD3(+)CD4(-)CD8(-)alphabeta TCR(+) Double Negative T cells are decreased in the peripheral blood of patients with multiple myeloma which correlates with disease burden[J].Br J Haematol,2009,144(5):686-695.

[7]Braga WM,Atanackovic D,Colleoni GW.The role of regulatory T cell and TH17 cells in multiple myeloma[J].Clin Dev Immunol,2012,2012:293479.