趋化因子CXCL9在结直肠癌中的表达及其临床意义

洪亮 程志俭 殷庆章 徐宏智 汤承辉 龚梨峰

(复旦大学附属上海市第五人民医院普外科，上海 200240)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)的发病率居世界恶性肿瘤的第2位，占恶性肿瘤总发病人数的9.74%，且其发病率呈上升趋势，尤其在发展中国家[1]。侵袭和远处转移是CRC患者预后不良的主要原因[2]。趋化因子是一类小分子蛋白多肽，属于具有化学趋化作用的细胞因子超家族。现已有超过50种的趋化因子被确认，其中，CXCL9、CXCL12、CXCL16、CXCL10等与肿瘤关系密切[3-4]。目前，关于CXCL9在CRC中的表达及其与肿瘤的发生、发展及患者预后的关系鲜有报道。本实验探讨CXCL9在结直肠癌中的表达及其与CRC临床病理因素间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2011年7月—2012年12月在复旦大学附属上海市第五人民医院行根治性手术治疗的60例CRC患者(CRC组)，均经术前活体组织检查确诊，临床资料完整，且未接受任何治疗。60例CRC患者中，男性39例，女性21例；年龄45～80岁，平均年龄(58.5±7.3)岁；结肠癌44例，直肠癌16例；肿瘤直径<5 cm 32例，≥5 cm 28例；Dukes A期19例，B期12例，C期14例，D期15例；有淋巴结转移19例，无淋巴结转移41例；右半结肠切除术19例，左半结肠切除术14例，乙状结肠切除术7例，横结肠切除术4例，直肠癌根治术16例。另选20例健康志愿者作为对照组，其中男性13例，女性7例；年龄38～62岁，平均年龄(45.3±6.8)岁。

1.2 标本采集 组织采集：术中取新鲜CRC组织、癌旁组织、正常结直肠组织和区域淋巴结(每例2份)，分别于4%甲醛溶液中固定，置于-80 ℃超低温冰箱中保存；癌旁组织取自距癌组织≤1 cm的组织；正常结直肠组织取自距癌组织≥5 cm的组织；区域淋巴结取自肠周系膜组织，HE染色后确定转移情况。血清采集：CRC患者入院后未接受任何治疗，于入院后第1天清晨6时空腹抽取静脉血5 mL，肝素抗凝，于4 ℃冰箱静置1 h，然后以3000 r/min离心15 min，抽取上清液，-20 ℃冻存待检。健康志愿者的血清收集方法如前所述。

1.3 主要试剂 ELISA试剂盒购自美国R&D公司，抗人CXCL9单克隆抗体、二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)、S-P免疫组织化学试剂盒均购自美国Santa Cruz生物技术公司，Trizol购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒购自日本Takara公司，SYBR Green预混液购自美国ABI公司。

1.4 方法

1.4.1 CXCL9的表达及结果判定 将CRC组织、癌旁组织、正常结直肠组织和区域淋巴结进行石蜡包埋，以4 μm的厚度切片、烤片、脱蜡返水、抗原修复。采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin-perosidase，SP)进行免疫组化染色，CXCL9抗体工作浓度为1∶150，二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)染色，常规苏木素复染、脱水、透明、中性树胶封片。用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)代替一抗作为阴性对照。免疫组织化学染色结果由2位病理科医师分别双盲阅片。在光镜下，随机选择10个高倍视野(×400)，计数1000个细胞，采用许良中等[5]的计分方法，即无着色记为0分，着色弱记为1分，着色适中记为2分，着色深记为3分；无着色记为0分，阳性细胞百分比≤10%记为1分，11%～50%记为2分，51%～75%记为3分，>75%记为4分。2项计分乘积>3分为阳性，否则为阴性。

1.4.2 CXCL9 mRNA的表达 取CRC组织、癌旁组织、正常结直肠组织和区域淋巴结，用Trizol抽取RNA，逆转录合成cRNA，然后采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time polymerase chain reaction，Real-Time PCR)法检测CXCL9 mRNA，引物序列参照Huang等[6]设计。CXCL9上游引物：5′-GGCATCATCTTGCTGGTTCT-3′；下游引物：5′-TCACTCTGCTGAATCTGG-3′。内参3-磷酸甘油脱氢酶(3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物：5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′；下游引物：5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。PCR条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；72 ℃总延伸5 min。目的基因CXCL9 mRNA的相对表达量以CXCL9和GAPDH的比值计算。

1.4.3 血清CXCL9的浓度 实验前将试剂、样本于室温中放置2 h，采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清CXCL9的浓度。按试剂盒说明稀释标准品，加样，37 ℃孵育30 min；洗板5次，每孔依次加入50 μL酶标抗体，37 ℃孵育30 min；洗板5次，每孔依次加入显色剂A、B各50 μL，避光显色10 min；加入终止液，15 min内在酶标仪(波长450 nm)上读取OD值。根据标准品的浓度及相应OD值计算出标准曲线，并以此计算出各样本CXCL9的浓度。

2 结 果

2.1 CXCL9在各组织中的表达 免疫组织化学染色结果显示，CXCL9主要表达于细胞膜、细胞质中，呈淡黄色或棕黄色，间质不着色，见图1。正常结直肠组织、癌旁组织、无癌转移的区域淋巴结中的CXCL9蛋白表达阳性率均显著低于CRC组织；有癌转移的区域淋巴结中CXCL9蛋白表达阳性率显著高于无癌转移的区域淋巴结，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。Real-Time PCR结果显示，各组织中均可见CXCL9 mRNA的表达；正常结直肠组织、癌旁组织、CRC组织中CXCL9 mRNA的表达依次增强，CRC组织中CXCL9 mRNA相对表达量显著高于癌旁组织、正常结直肠组织及无癌转移的区域淋巴结(P<0.01)。

表1 各组织中CXCL9蛋白表达阳性率的比较(n，%)

A：CRC组织；B：癌旁组织；C：区域淋巴结；D：正常结直肠组织

2.2 CXCL9的表达与CRC临床病理因素的相关性分析 随着浸润深度、Dukes分期的增加，CXCL9的阳性表达率明显增加(P<0.05)；无淋巴结转移的CRC患者CXCL9 阳性表达率显著高于有淋巴结转移患者，差异均有统计学意义(P<0.05)；不同年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤直径的CRC患者CXCL9的阳性表达率差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 CRC组织中CXCL9的表达与临床病理因素的关系(n，%)

2.3 CRC组与对照组血清CXCL9浓度的比较 CRC组血清CXCL9平均浓度为(28.43±6.41)ng/L，高于对照组(7.65±1.32)ng/L，差异有统计学意义(P<0.05)；随着CRC Dukes分期的增加，血清CXCL9的平均浓度增加，差异有统计学意义(P<0.05)。无淋巴结转移CRC患者血清CXCL9的平均浓度[(31.84±5.73)ng/L]高于有淋巴结转移患者[(20.87 ±3.62)ng/L]，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2～3。

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

与对照组比较，**P<0.01，与有淋巴结转移组比较，△P<0.05,△△P<0.01

3 讨 论

CRC的发病因素复杂，通常与感染、免疫、遗传等因素有关。肿瘤的浸润和转移是CRC患者的主要死因，CRC患者中有50%～60%发生肿瘤远处转移，患者的5年生存率不足10%[7]。肿瘤的浸润和转移机制目前尚不清楚。研究[8]表明，肿瘤微环境在肿瘤浸润和转移中起重要作用。有研究[9-11]表明，CCL2、CCL3、CCL4、CCL5等炎性趋化因子和CXCL1、CXCL5、CXCL8等血管生成性趋化因子的表达水平在CRC组织中较正常组织明显升高，提示这些趋化因子及其受体在CRC的进展、血管发生及肿瘤转移过程中发挥重要作用。然而，抗血管生长因子CXCL9在CRC中的作用近年来才逐渐受到关注。

CXCL9又称Mig，即γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)诱导的趋化因子，由巨噬细胞及单核细胞分泌，主要趋化活化的T细胞，并在急性移植物抗宿主病中起重要作用。在恶性黑色素瘤中，CXCL9通过趋化T淋巴细胞至肿瘤部位而抑制肿瘤生长。同时，CXCL9与其配体CXCR3结合后可抑制肿瘤血管生成。 近年来的研究[3-4,12]显示，在胃癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、口腔鳞状细胞癌、黑色素瘤、淋巴瘤等患者的肿瘤组织及血清中均可检测到CXCL9的高表达。本研究发现，CRC组织中CXCL9蛋白及mRNA的均呈高表达，显著高于正常结直肠组织和癌旁组织(P<0.01)，有癌转移的区域淋巴结中CXCL9表达显著高于无癌转移的区域淋巴结(P<0.01)。本研究发现，随着浸润深度、Dukes分期的增加，CXCL9的阳性表达率明显增加，且无淋巴结转移CRC患者CXCL9蛋白的表达显著高于有淋巴结转移患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。不同年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤直径的CRC患者间CXCL9的表达水平比较，差异均无统计学意义。此外，本研究还发现，CRC患者的血清CXCL9平均浓度高于健康志愿者(P<0.05)；在Dukes分期不同的CRC患者中，CXCL9的平均浓度有升高趋势，差异有统计学意义(P<0.05)；且无淋巴结转移CRC患者血清CXCL9浓度显著高于有淋巴结转移患者(P<0.05)。以上结果显示，CXCL9在CRC组织中呈过表达状态，且血清CXCL9含量可能与肿瘤负荷及远处转移相关。

综上所述，趋化因子CXCL9可能参与CRC的发生、发展过程，其表达水平与CRC的浸润深度、临床分期、转移等因素有关。随着研究的不断深入，趋化因子CXCL9可能会成为CRC复发、远处转移及预后的预测指标，并有望为进一步研究CRC的发病机制以及生物治疗靶点提供新的策略。

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