6MV-X线对人食管癌细胞系EC-9706Bcl-2基因表达的影响

张海鸽

6MV-X线对人食管癌细胞系EC-9706Bcl-2基因表达的影响

张海鸽

目的 研究X线对人食管癌细胞系EC-9706 B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)基因表达的影响。方法 采用RT-PCR法测人食管癌细胞系EC-9706经0、4、6 Gy的X线照射后1、6、24 h Bcl-2基因表达的变化。结果 X线照射可以显著降低人食管癌细胞株EC-9706Bcl-2基因的表达。结论 X线照射人食管癌细胞系EC-9706细胞后Bcl-2基因的表达在0～6 Gy无剂量依赖性, 在不同的时间点上Bcl-2的表达稳定。

人食管癌细胞系；Bcl-2；RT-PCR

食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤, 放疗是主要的治疗方法之一。放疗的主要机制是诱导细胞凋亡。Bcl-2是目前发现的抗凋亡作用最强的基因之一, Bcl-2的高表达可以抑制正常细胞或肿瘤细胞的凋亡。本文采用RT-PCR法检测X线作用后Bcl-2基因表达的变化, 进而探讨该基因与食管癌放疗敏感性之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 RPMI-1640培养液, 标准胎牛血清、胰蛋白酶、TRIzolR Reagent、PCR反应试剂盒、PCR引物、反转录试剂盒、GAPDH基因、Bcl-2基因、培养皿35 mm×10 mm。仪器设备：水套式CO2培养箱、置显微镜、紫外分光光度计、实时定量PCR仪、台式高速离心机、低温离心机、PE管、PCR反应管。人食管癌细胞系EC-9706购自中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室。

1.2 方法

1.2.1 将细胞培养至对数期, 制备单细胞悬液, 以2×106个细胞分别接27个培养皿中, 注意尽量使细胞分散均匀, 将27个培养皿置入培养箱内培养24 h后分成三组。以酒精消毒医用直线加速器治疗床, 铺双层湿毛巾补偿厚度使总厚度达到1.5 cm, 培养皿置于其上, 以0、4、6 Gy的6MV-X线分别照射, 照射时培养皿置于照射野边缘2 cm以内, 机头旋转180°,射线从下方入射, 剂量率2 Gy/min。SSD(源皮距)为 100 cm, 射野大小为22 cm×15 cm。照射后立即送回实验室,更换培养液, 在培养箱内继续培养。在照射后1 h时, 每剂量组各取3皿, 制备成单细胞悬液, 用吸管移至无菌离心管,以1000 rpm转速离心5 min, 悬浮细胞沉淀后弃去上清, 再用PBS清洗1次, 再次离心并弃去上清, 放入-80℃冰箱保存。至6、24 h时重复上述操作。

1.2.2 用TRIZOL试剂提取所收集细胞的总RNA(按操作说明进行),紫外分光光度计测定所提取样本在波长260 nm和在波长280 nm处的吸光度(OD260和OD280),计算RNA的纯度和浓度,确保RNA的纯度在1.9～2.0。以琼脂糖电泳检测RNA的完整性, 各样本均出现三条清晰条带且无弥散, 从上至下分别是5、18和28srRNA, 且经分析28srRNA的亮度约是18srRNA的1.5～2.0倍, 说明所提取的总RNA完整性好,无RNA酶的降解。将所提取的样本总RNA置于-80℃保存备用。

1.2.3 引物的设计与合成 Bcl-2和GAPDH上下游引物参照文献, Bcl-2［1］上游：CTGGTGGGAGCTTGCATCAC下游：ACAG CCTGCAGCTTTGTTTC GAPDH［2］；上游：TGGGCTACACTGAGCA CCAG, 下游：CAGCGTCAAAGGTGG AGGAG。

1.2.4 cDNA的合成 利用TaKaRa反转录试剂盒(ExScriptTM RT-reagent Kit)将提取的RNA进行反转录, 在反应体系为10 µl的逆转录反应管中加入组分, 见表1。

表1 10 µl RNA反转录体系

反应条件：1.37℃ 15 min；2.85℃ 5sec；按反应条件操作, 即可得到cDNA, -20℃保存。

1.2.5 Real-Time 荧光定量PCR反应 以逆转录生成的cDNA为模板, 进行实时荧光定量PCR扩增。Bcl-2为目的基因, 内参基因为GAPDH, 本实验采用TaKaRa Real-Time Quantitative PCR试剂盒进行。在冰上进行PCR反应液的配制。反应条件严格遵照试剂盒说明书。在PCR反应管内加入组分,见表2。

1.3 统计学方法 采用统计学软件SPSS11.0进行统计分析。计量资料以均数±标准差( x-±s)表示, 采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

照射后, 同一时间点上4 Gy组和6 Gy组与对照组(0 Gy)比较, Bcl-2基因的表达随剂量的增加而减少, 并且下降急剧。将对照组分别与4、6 Gy组进行比较, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。4 Gy组与6 Gy组进行对比提示差异无统计学意义(P＞0.05), 说明照射剂量增加并未影响Bcl-2的表达。见表3。

表2 20 µl PCR反应体系

表3 照射后Bcl-2基因表达相对量( x-±s)

3 讨论

Bcl-2是迄今研究最深入、最广泛的凋亡调控基因之一。细胞凋亡受凋亡相关基因调控, 在肺癌、前列腺癌、乳腺癌以及结肠癌等实体瘤的细胞中发现Bcl-2的异常表达使肿瘤细胞存活时间延长, 同时还抑制化疗药物、放射线、癌基因等多种因素介导的细胞凋亡, 使治疗变得困难。通过上述实验提示食管癌也高表达Bcl-2蛋白, 因此研究Bcl-2基因对于食管癌的放化疗及综合治疗具有一定的临床意义。

张维珍等［3］的研究结果显示Bcl-2的表达与放疗疗效呈负相关, 提示Bcl-2阳性表达尤其是高表达时应考虑调整放疗方法和剂量。为了探讨6MV-X线对食管癌细胞系EC-9706的杀伤机制, 作者对各分组EC-9706细胞内Bcl-2的mRNA采用荧光定量RT-PCR技术进行了检测。结果显示, 4 Gy X线照射后1 h, Bcl-2基因的表达急剧下降, 与其他研究的结论相符, X射线可降低Bcl-2的表达。以＞4 Gy剂量照射后, Bcl-2的表达却与4 Gy组基本相同, 而以＜4 Gy的剂量照射其表达的变化情况有待进一步研究。因为Bcl-2是凋亡抑制基因, 故而又被称为细胞的“生死开关”, 作者认为放射线对食管癌细胞的杀灭, 与射线降低Bcl-2表达启动了细胞凋亡程序有关。

［1］ Tsujimoto Y, Croce CM.Analysis of the structure,transcripts,and protein products of bcl-2, the gene involved in human follicular lymphoma.Proc Natl Acad Sci USA, 1986(83):5214-5218.

［2］ Hidetoshi T, Akira M, Akemi I, et al.Aberrant expression of apoptosis-related molecules in psoriatic epidermis.Journal of Dermatological Science, 2002(28):187-197.

［3］ 张维珍,张阳,孔天东,等.食管癌中C-erbB-2, bcl-2, mdr-1的表达与同步放化疗疗效及预后关系的研究.实用诊断与治疗杂志, 2007, 21(12):921-923.

2014-08-11］

471000 郑州大学附属洛阳市中心医院放疗科