附子及附子、干姜配伍对H2O2导致心肌细胞损伤的抗氧化作用*

耿 姗 葛华雯 王新宇 梁 涛

（南京中医药大学，江苏 南京 210023）

·研究报告·

附子及附子、干姜配伍对H2O2导致心肌细胞损伤的抗氧化作用*

耿 姗 葛华雯 王新宇 梁 涛△

（南京中医药大学，江苏 南京 210023）

目的 观察附子及附子、干姜配伍对H2O2诱导的乳鼠心肌细胞抗氧化作用。方法 取1～3 d乳鼠的心肌细胞，常规培养，观察心肌细胞形态学，以免疫组化进行心肌细胞纯度鉴定。实验分为对照组、模型组、附子水煎液组20 mg/mL，附子干姜水煎液组20 mg/mL，预处理2 h后，用1 mmol/L H2O2氧化损伤2 h，检测培养液中心肌细胞跳动频率，丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果 与模型组相比，用附子水煎液和附子干姜水煎液预处理后的心肌细胞跳动频率增加 （P＜0.01），附子干姜水煎液组SOD活性明显提高 （P＜ 0.01）。结论 附子干姜水煎液对H2O2诱导的心肌细胞损伤具有一定的保护作用。

心肌细胞 附子 干姜 丙二醛 超氧化物歧化酶

中药的药性是中药理论的核心，也是中医理论指导下使用药物的依据。附子与干姜同属辛热，两者辛热同施，是热热配伍的典型代表［1］。干姜附子汤由干姜、附子配伍组成，方中附子辛热有毒，为纯阳之品，具有回阳救逆助阳补火散寒止痛的功效，多用于亡阳虚脱肢冷脉微等阳虚或亡阳的患者；干姜辛热无毒，具有温中散寒回阳通脉温肺化饮的功效。已有文献报道，姜附汤对阿霉素心脏毒性具有一定保护作用，其机制可能与抗氧化作用有关，同时也有研究认为，姜附汤的化学成分研究提示，干姜与附子均含有抗氧化成分［2-3］，本实验通过细胞水平，采用H2O2诱导心肌细胞损伤，观察附子水煎液和附子、干姜水煎液抗氧化应激的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 日龄1～3 d的SD乳鼠，清洁级，雌雄不限，动物合格证号SCXK（沪）：2007-0005，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。

1.2 试药与仪器 附子（黑顺片）、干姜原药材购于南京解放军第454医院药剂科。DMEM培养基：Gibco。胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司。一抗（α-Sarcomeric actin）：南京建成生物工程研究所。胶原酶Ⅰ型：Sigma；5-溴脱氧尿嘧啶：Sigma。胰蛋白酶：Sigma。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）测试试剂盒：南京建成生物工程研究所。IX51倒置相差显微镜，日本Olympus产品。孵箱：上海精宏实验设备有限公司。烤箱：上海圣欣科学仪器有限公司101AS-3。SyneRgy HT酶标仪：美国Bio-Tek。

1.3 心肌细胞的原代培养 参考文献［4］改良，取SD大鼠无菌开胸，暴露心脏，于心脏收缩期剪下心脏，放于预冷的盛有1%双抗的Hank’s液的培养皿中，清洗后移至培养皿中，将心尖剪为1 mm3碎块，加入0.1%Ⅰ型胶原酶和0.06%胰蛋白酶的混合酶4 mL，消化10 min，反复消化2～3次，每次30 min，至组织消化成半透明状时终止消化，200目细胞筛过滤至预冷的完全培养基，1000 r/min离心10 min，加20%DMEM吹匀。细胞悬液放CO2培养箱差速培养60 min去除成纤维细胞，2 d后第1次换液，培养前3 d加入0.1 mmol/L 5-溴脱氧尿嘧啶抑制成纤维细胞生长。

1.4 心肌细胞的免疫组化鉴定 将爬有细胞的盖玻片用PBS洗2遍，然后加入4%的多聚甲醛固定1～5 h。将固定好的细胞爬片加几滴PBS覆盖15 min，然后用PBS洗3遍。在爬片上加1%的triton-100，室温放置15 min。PBS浸泡5 min，清洗3次，加灭活酶，洗涤，加入一抗（α-Sarco-meric actin，α-SCA）100 μL，37℃，湿盒孵育2 h，洗涤，加入 HRP标记二抗 50 μL，室温37℃，孵育30 min，洗涤，DAB法显色。在光学显微镜下观察、拍照。阳性结果判断：以细胞内出现棕褐色为阳性，非心肌细胞不着色为阴性。

1.5 附子和附子干姜汤对H2O2诱导的乳鼠心肌细胞损伤的氧化作用 将处理好的心肌细胞分为对照组和模型组。对照组：以含10%胎牛血清DMEM培养细胞；模型组：在培养基中加入终浓度为1 mmol/L的H2O2孵育2 h；附子水煎液组：培养后，加入20 mg/mL附子水煎液预处理2 h，再在培养基中加入终浓度为1 mmol/L的H2O2孵育2 h；附子干姜水煎液组：培养后，加入20 mg/mL附子干姜水煎液预处理2 h，再在培养基中加入终浓度为1 mmol/L的H2O2孵育2 h。

1.6 指标检测 （1）心肌细胞形态学观察：培养48 h后，在倒置显微镜下观察心肌细胞形态、生长状态、搏动频率，以判断心肌细胞生长状况是否良好。（2）心肌细胞免疫组化鉴定：判断是否是心肌细胞以及阳性表达率。（3）对H2O2诱导的乳鼠心肌细胞损伤的检测：①不同处理后的心肌细胞，显微镜下观察并计数心肌细胞的搏动频率。②酶标仪检测细胞培养上清液MDA水平与SOD活性，严格按照试剂盒说明书的步骤操作。

1.7 统计学处理 运用SPSS15.0统计软件。计量资料以（s）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 心肌细胞形态学观察 由倒置相差光学显微镜下可见，刚接种的心肌细胞悬浮于培养液中，培养4～ 6 h后，细胞开始贴壁生长；培养24 h后，部分细胞逐渐变为梭形或多边形，逐渐在瓶壁表面铺展；培养48 h后，细胞在瓶壁铺展状况更加明显，形成不规则的星形，并伸出伪足，部分细胞开始搏动。培养72 h后，部分细胞交织成网，形成一片，单个细胞或片状细胞自律搏动，搏动节律、强度稳定。见图1。

图1 倒置相差显微镜下乳鼠心肌细胞的形态

2.2 心肌细胞免疫组化鉴定 见图2。经免疫组化鉴定，在光学显微镜下观察、拍照。阳性结果判断：以细胞内出现棕褐色为阳性，非心肌细胞不着色为阴性，心肌细胞阳性率达95%以上，提示心肌细胞纯度较理想。

图2 α-SCA阳性心肌细胞（100倍）

2.3 附子和附子干姜汤对H2O2损伤心肌细胞跳动频率、SOD及MDA的影响 见表1。由表1可知，模型组MDA值显著高于对照组（P＜0.01），而跳动频率和SOD值显著低于对照组（P＜0.01），附子干姜水煎液可减少H2O2损伤后跳动频率下降，使细胞内SOD含量增加，与模型组相比差异明显（P＜0.01），但在降低MDA含量方面，仅有下降趋势。附子水煎液可明显增加H2O2损伤后跳动频率，但对MDA和SOD影响不大。

表1 各组H2O2损伤心肌细胞跳动频率和SOD、MDA水平比较（s）

表1 各组H2O2损伤心肌细胞跳动频率和SOD、MDA水平比较（s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照组比较，△P＜0.01。

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3 讨 论

在出生1～3 d的新生大鼠，心肌细胞具有部分增殖能力［4］，在乳鼠心肌细胞培养过程中，消化酶及其浓度的选择很重要，有用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶的混合酶或Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶的混合酶作为消化酶［5-6］。由于胰蛋白酶能分解组织间的蛋白，且对细胞膜有较强破坏作用，胶原酶作用比较温和，但难以消化完全，需要时间较长［7］。本实验采用0.1%Ⅰ型胶原酶和0.06%胰蛋白酶的混合酶分步消化，以减轻胰蛋白酶或胶原酶对心肌细胞的损伤。本实验通过差速贴壁60 min，可去除大量成纤维细胞，加入终浓度为0.1 mmol/L的Brdu来抑制成纤维细胞的DNA和蛋白质的合成，从而达到纯化心肌细胞的目的，通过免疫组化鉴定，心肌细胞阳性率达95%以上。

目前已有文献报道，干姜与附子具有抑制心肌氧化反应和超氧阴离子自由基产生的作用［8］。MDA是脂质过氧化应激反应的终产物，SOD是机体内重要的抗氧化应激酶。本实验结果显示，附子及附子干姜水煎液组具有增加心肌细胞跳动频率，强心作用；在氧化应激方面，附子干姜水煎液组提高SOD活性明显优于附子组，附子单用在提高SOD活性方面不明显；但在降低MDA活性方面，附子水煎液及附子干姜水煎液均作用不明显，仅有下降趋势，目前原因并不清楚，附子干姜抗氧化应激深入机制有待于今后进一步研究。

［1］ 黄颖，武乾，石晓路，等.附子、干姜配伍机制现代研究概述［J］.中华中医药学刊，2013，31（9）：1884.

［2］ 柳乃奎，黄雪松．脱氢姜酮、姜酚肟对两种自由基的清除作用［J］．食品科学，2004，25（6）：72．

［3］ 刘古锋，吴伟康，段新芬，等．附子多糖对力竭运动小鼠心肌过氧化损伤的保护作用［J］.海南医学，2008，9（7）：68-69．

［4］ 孟云辉，李永新，于慧卿，等.新生SD大鼠心肌细胞的原代培养［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2014，12（1）：78-79.

［5］ 王佳南，张晓刚，汤为学，等.新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良［J］.重庆医科大学学报，2009，34（5）：600-603.

［6］ 张乃菊，陈天平，祝晓光.乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞的原代培养［J］.蚌埠医学院学报，2010，35（6）：558-561.

［7］ 郭舜，张树江，段蕊，等.新生SD大鼠心肌细胞原代培养方法改进［J］.中药药理与临床，2012，28（6）：139-141.

［8］ 吴伟康，罗汉.四逆汤清除氧自由基及抑制心肌脂质过氧化反应的体外实验［J］．中国中药杂志，1995，11（20）：701-702.

Antioxidant Effect of Aconite and Compatibility of Aconite dried and Ginger on Neonatal Rats'Myocardial Cells induced by H2O2

GENG Shan，GE Huawen，WANG Xinyu，et al. Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu，Nanjing 210023，China

Objective：To investigate the antioxidant effect of aconite and compatibility of aconite dried ginger pretreatment on neonatal rat myocardial cells induced by H2O2.Methods：Myocardial cells were clipped from 1～3 days of neonatal rat.Cell morphologic change was observed under an inverted microscope and purity identification of myocardial cells were studied by immunohistochemistry.Different groups were set after conventional cultur，such as normal groups，the model groups，20 mg/kg aconite decoction groups，20 mg/kg aconite and dried ginger decoction.After pretreatment 2 hours and the 1 mmol/L H2O2oxidative injury 2 hours.The different groups were observed about cell pulsating.The activity of MDA and SOD was detected.Results：Compared with model groups，in the aconite and dried ginger decoction pretreatment group，the beating rate of the myocardial cell was increased（P＜0.01）.The SOD activity were also improved（P＜0.01）.Conclusion：It has the protective effect of the aconite and dried ginger decoction on myocardial injury induced by the H2O2.

Myocardial cells；Aconite；Dried ginger；MDA；SOD

R285.5

A

1004-745X（2014）11-2012-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.11.019

2014-07-23）

南京中医药大学国家自然基金预研基金（12XYY08）

△通信作者