搜风祛痰法对ApoE基因敲除小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达的影响*

李 颖宫丽鸿

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）

·研究报告·

搜风祛痰法对ApoE基因敲除小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达的影响*

李 颖1宫丽鸿2△

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）

目的 通过观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）的表达水平，来阐明搜风祛痰法中药对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块的干预作用机制。方法 制备ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型，随机分为5组：模型组、稳斑汤低剂量组、中剂量组、高剂量组及西药（他汀）组，另设空白对照组。采用HE染色、Masson染色法用于实验观察，应用RT-PCR法检测PPAR-γmRNA的表达。结果 与空白组、模型组相比，稳斑汤各剂量组及西药组PPAR-γ mRNA表达水平明显升高（P<0.01）。结论 稳斑汤可以提高PPAR-γmRNA表达水平，对小鼠动脉粥样硬化有一定稳定斑块的效应，因剂量不同而各异。

搜风祛痰法 ApoE基因敲除 小鼠 动脉粥样硬化 不稳定斑块 过氧化物酶体增殖物激活受体γ

动脉粥样硬化是心脑血管疾病的重要病理基础，也是临床心脑血管疾病发生和引起死亡的主要原因。近年来患病人群有逐步年轻化趋势，严重危害人类身体健康。本实验旨在观察搜风祛痰法中药对小鼠PPAR-γ mRNA表达的影响，以此来研究其对动脉粥样硬化不稳定斑块的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物造模及分组 选6～8周龄ApoE基因敲除小鼠70只，饲以含脂肪21%、胆固醇0.15%的高脂饲料13周后，随机处死4只，取主动脉根部HE染色观察，确定易损斑块［1］的形成，造模成功。成模小鼠60只随机分为5组每组12只：模型组、稳斑汤低剂量组、中剂量组、高剂量组及西药组。

1.2 药物 稳斑汤组成：全蝎5 g，蜈蚣1条，地龙10 g，陈皮15 g，半夏15 g，白术15 g，水蛭15 g。由辽宁中医药大学附属医院中药局提供，加工制成含生药2 g/mL中药浓缩液备用。

1.3 给药方法 根据成人每日用药临床推荐的常用剂量，按成人与小鼠的体质量折算系数9.0折算成小鼠用量：稳斑汤低剂量组10 g/（kg·d）、中剂量组20 g/（kg·d）、高剂量组40 g/（kg·d），西药组予他汀6 mg/（kg·d），模型组给予0.3 mL/d的生理盐水。灌胃给药每日1次，继续喂养13周。另取正常小鼠12只予正常饲料喂养13周，设为空白对照组。

1.4 标本采集与检测 取材前夜禁食，经小鼠眼眶静脉丛采血，离心分离血清，-80℃冻存，用作测定血清过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）蛋白浓度。无菌条件下取出心脏及主动脉，心脏10%甲醛固定，主动脉放在冻存管内液氮骤冷保存。

1.4.1 主动脉组织病理学观察 每组随机取10只小鼠，麻醉处死，无菌条件下每只小鼠的主动脉根部取4个相同的切面，生理盐水冲洗，10%甲醛中性溶液固定。常规石蜡包埋，均匀间断切片。HE染色，普通光镜下观察主动脉根部组织及斑块的形态结构；Masson染色，普通光镜下观察各斑块中纤维成分的分布。

1.4.2 定时定量RT-PC检测 先提取总RNA，然后取4 μL总RNA经反转录酶及随机引物等反应物混合配成20 μL体系，42℃15 min，95℃，2 min反转录成cDNA，随后进行实时荧光定量PCR反应，对小鼠PPAR-γ的表达进行测定。引物序列：上游引物5′-AC CACTCGCATTCCTTTGAC-3′，下游引物5′-ATCGCA CTTTGGTATTCTTGGAG-3′。扩增片段长度为154 bp。

1.5 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件学分析。计量资料以（s）表示。组间比较用t检验，多组均数比较用方差分析，不同指标间用直线相关分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 腹主动脉病理切片比较 见图1。空白对照组动脉内膜附有一层内皮细胞，内皮细胞层呈现皱褶状排列，但排列均匀，表面光滑，未见泡沫细胞及炎性细胞。模型对照组：血管腔内可见明显的粥样硬化斑块出现，斑块表面附有纤维帽，纤维帽主要由平滑肌细胞、弹力纤维和胶原组织构成，斑块中央可见大量的脂质聚集，斑块内可见大量泡沫细胞，偶见炎性细胞浸润。出现斑块的动脉内膜区域严重破损。稳斑汤低剂量组：血管腔内可见粥样硬化斑块，斑块面积明显小于模型对照组，斑块内脂质含量较模型组少，斑块内可见少量泡沫细胞及炎性细胞。偶见内膜残缺。稳斑汤中、高剂量组及西药组：动脉内膜大部分较为光滑，偶见内膜不全，内膜不全区域可见明显的脂质条纹块形成，偶见泡沫细胞聚集，有少量纤维成分交联。

图1 各组小鼠腹主动脉HE染色（100倍）

2.2 PPAR-γ mRNA表达水平比较 见图2，表1。模型对照组PPAR-γ mRNA表达最低，稳斑汤各剂量组及西药组表达明显高于空白组及模型对照组 （P< 0.01）。稳斑汤各剂量组PPAR-γ mRNA表达比模型对照组明显升高（P<0.01），与低剂量组相比，中高剂量组提高PPAR-γ mRNA表达更明显。

图2 各组小鼠腹主动脉组织中PPAR-γ mRNA表达电泳图

表1 各组小鼠腹主动脉组织中PPAR-γ mRNA表达水平（s）

表1 各组小鼠腹主动脉组织中PPAR-γ mRNA表达水平（s）

与空白对照组比较，*P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.01。

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3 讨 论

过氧化物酶体增殖激活物受体（PPARs）属于核激素受体家族，是能被脂肪酸样化合物过氧化物酶体增殖剂和脂肪酸激活的核转录因子，是一种配体激活的核受体。PPARs包括3个亚型，即α亚型、β亚型和γ亚型，其中PPARγ经证实可以在血管、心脏、脂肪、肌肉、肝脏等多器官细胞中表达，是许多细胞信号转导过程中的关键因子，有多种生物学效应。PPARγ是PPARs中最具脂肪组织特异性的成员，参与糖、脂肪、能量代谢等过程，调节脂质代谢、脂肪细胞分化和胰岛素敏感性［2］。PPARγ具有改善脂质及调节泡沫细胞形成的作用，从而改善动脉粥样硬化的病情［2］；PPARγ能够抑制大鼠巨噬-泡沫细胞的形成，从而抑制动脉粥样硬化的发生［4］；PPARγ同时还与冠状动脉粥样硬化的多个相关因素有关，包括炎症、高血压、高脂血症、胰岛素抵抗等［5］。因此PPARγ可能与冠状动脉粥样硬化的产生有关［6］。

冠心病属中医“胸痹”、“真心痛”的范畴。本病的发生多与寒邪内侵、饮食失调、情志失节、劳倦内伤、年迈体虚等因素有关。其病机有虚实之分，实为寒凝血瘀、气滞痰浊，痹阻胸阳，阻滞心脉；虚为气虚、阴伤、阳衰，肺脾肝肾亏虚，心脉失养。中医认为风为百病之长，其性善行而数变，痰为百病之祟，这与动脉粥样硬化斑块的不稳定性有相似之处，又有久病入络，治宜搜风通络祛痰，从痰从风论治。本实验稳斑汤方中全蝎、蜈蚣具有息风止痉、攻毒散结、通络止痛之效。地龙具有清热息风、通络利尿之效。陈皮、半夏、白术，三者既能燥湿化痰，又能理气健脾消痞散结。水蛭为虫类活血化瘀药，破血逐瘀而不伤新血。诸药合用共奏搜风祛痰通络之功效。现代药理研究证实，全蝎能增加心肌收缩力，有抗血栓形成、扩张血管、降低血压的作用［7］；蜈蚣有抗心肌缺血［8］、加强心肌收缩力和扩血管的作用；地龙具有解热镇静、抗惊厥、平喘、抗血栓、降压等作用［9］；陈皮能抑制血小板聚集，能降低血脂、预防动脉硬化及抗血液高凝状态作用［10］；水蛭能增加脑血流量，改善脑缺氧状况，降低血流黏稠度及降血脂，抑制体内外血栓形成［11］。上药合用，能够更好地起到稳定动脉粥样硬化斑块的作用。

本实验研究显示，搜风祛痰法中药能有效地提高细胞中PPAR-γ mRNA的表达，调节脂质代谢，从而有效地防止动脉粥样硬化的发展，为治疗提供理论基础，但其全面深入的作用机制还有待进一步研究探讨。

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Effect of Searching Wind and Removing Phlegm Method on Peroxisome Proliferator-activated Receptorγ Expression of ApoE-gene Knockout Mice

LI Ying1，GONG Lihong2. 1 Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang 110032，China；2 Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang 110032，China

Objective：To observe PPAR-γ expression level and to clarify the intervention mechanism of searching wind and removing phlegm method of traditional Chinese medicine on unstable atherosclerotic plaque of ApoE knockout mice.Methods：ApoE knockout mice with AS were randomly divided into 5 groups including model group，Wenban Decoction low dose group，Wenban Decoction middle dose group，Wenban Decoction high dose group，and the western medicine statin group.The pathological examinations such as HE staining and Masson staining method were used.Expressions of PPAR-γ mRNA were detected by RT-PCR.Results：Compared with the blank group and model group，PPAR-γ mRNA expression level in traditional Chinese medicine dose groups and western medicine group increased significantly（P<0.01）.Conclusion：Unstable plaque decoction can improve PPAR-γ mRNA expression level，and has the effect of stable plaques with different dose.

Searching wind and removing phlegm method；ApoE-gene knockout；Mice；Atheroscierosis；Unstable plaque；Peroxisome proliferator-activated receptor-γ

R285.5

A

1004-745X（2014）11-1968-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.11.003

2014-05-12）

中国博士后科学基金面上项目（20110491540）；辽宁省“百千万人才工程”资助项目（2011921022）

△通信作者