不同农作物根际自生固氮菌分离及固氮酶活性

李文凤　房翠翠　霍英芝

摘要：为了解高海拔地区农作物根际土壤自生固氮菌分布及优势菌株情况，以未施肥的油菜、玉米、青稞、小麦4种农作物种植点为采样地，对作物根际土壤自生固氮菌进行分离提纯，并根据其固氮酶活性筛选固氮能力较强的菌株。结果表明：油菜根际自生固氮菌数量较多，其固氮能力较其他3种作物更高，其中固氮性最好的菌株为德克斯氏菌属（Derxia spp.）菌株。

关键词：自生固氮菌；林芝；固氮酶活性；农作物；根际

中图分类号： S144.5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0385-02

收稿日期：2013-10-14

基金项目：西藏农牧学院青年科研基金（编号：XZ-20130625）。

作者简介：李文凤（1982—），女，陕西吴起人，硕士，讲师，主要从事土地资源与空间信息技术研究。Tel：（0894）5821066；E-mail：lwf1029@126.com。随着生活水平不断提高，人们对于饮食的卫生、安全、保健性更加注重，使生产者更加注重农业产业结构调整，因此产生了有利于环境保护和食品安全的农业生产即绿色农业。在种植方面，应采取生物方法防治病虫害，减少化肥、农药使用量，降低其残留度，通过改善农产品生产环境加快发展绿色食品、有机食品。目前，微生物肥料在农业领域越来越受到关注[1-2]，我国正致力于推广微生物肥料。固氮菌肥属于微生物肥料，在自然界氮循环中起着重要作用，施用固氮菌肥可提高土壤有效氮素、增加农作物产量[3-4]。 本研究以未施肥土壤的作物根际微生物为对象，分别对油菜、青稞、小麦、玉米的根际土壤自生固氮菌进行分离，测定其固氮酶活性，并筛选出具有高效固氮性的菌株，以期为固氮菌的有效利用提供参考。

1材料与方法

1.1土壤采集

供试土壤采自于西藏大学农牧学院实习基地农场。西藏大学农牧学院位于西藏林芝地区八一镇，海拔2 900 m，属热带湿润和半湿润气候，年降水量650 mm左右，年均温度 8.7 ℃，土壤显中性偏弱酸性（pH值6.5～7.0），有机质含量35%，全氮含量0.053%，速效磷含量9.9 mg/kg，速效钾含量26.8 mg/kg。采集非豆科类作物青稞、小麦、玉米、油菜的根际土壤，装入灭菌袋中，每个采样袋须记录采样环境、时间、日期、类型。及时分离土样，若不能及时分离应将土样保存在4 ℃冰箱内，并在2～3 d内尽快完成所有土样分离。

1.2培养基和主要仪器

自生固氮菌分离、培养分别采用固体、液体无氮培养基。无氮培养基：葡萄糖10 g、磷酸二氢钾0.2 g、硫酸镁0.2 g、硫酸钙0.2 g、氯化钠0.2 g、碳酸钙5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，调节pH值为6.5～7.0，121 ℃灭菌备用。液体培养基即上述培养基的液体培养基（不加琼脂）。

主要仪器：超净工作台、恒温培养箱、气相色谱仪、微量移液枪、冰箱、电子天平、显微镜、乙醇灯。

1.3自生固氮菌的分离和纯化[5]

1.3.1根际土壤自生固氮菌分离称取作物根际土壤10 g，放入灭菌后的三角瓶，加入95 mL灭菌水（0.85%生理盐水或蒸馏水），200～250 r/min振荡15 min，在无菌操作台中静置15 min，用移液枪吸取上层清液为试验菌液。吸取0.5 mL菌液注入4.5 mL 85%生理盐水中，振荡摇匀即稀释成10-1溶液；再从10-1溶液吸取0.5 mL菌液注入4.5 mL 85%生理盐水中，振荡摇匀即稀释为10-2溶液，依次可稀释至10-3、10-4、10-5、10-6溶液。用无菌玻璃棒把经过稀释的菌液（10-3、10-4、10-5、10-6溶液）均匀涂在固体无氮培养基平板上，在28 ℃培养箱中倒置培养7～14 d。采用平板计数法统计土壤中自生固氮菌的数量。

1.3.2根际土壤自生固氮菌纯化挑取少量菌液在固体无氮培养基上划线分离培养，培养后挑取单个菌落转接在斜面固体无氮培养基上，待菌落长出保存于4 ℃冰箱备用。

1.4菌株鉴定

1.4.1菌落外观特征通过划线培养观察单个菌落的外形特征。单个菌落为半透明圆形，乳白色，表面湿润光滑，中间凸起呈黏稠状。

1.4.2革兰氏染色观察选择划线培养的菌落，用草酸铵结晶紫染色1 min，水洗后加碘液覆盖再染色1 min，再次水洗后加95%乙醇溶液，轻摇培养皿脱色20 s后再次水洗，最后用番红染色2 min，冲洗后待干燥可进行镜检。

1.4.3荚膜染色选择划线培养的菌落用草酸铵结晶紫或石炭酸复红染液进行初染5 min，水洗后待干燥再用墨汁衬染，干燥后进行镜检。

1.4.4淀粉水解选择已培养的菌落，在培养皿上滴少量碘液，轻轻晃动培养皿使碘液均匀平铺。若菌株周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，呈阳性。可以根据透明圈大小判断水解淀粉的能力。

1.4.5油脂水解将菌株接种在油脂培养基中，在28 ℃恒温条件下培养5 d。若培养基中出现红色斑点，表明菌株能分解脂肪产生脂肪酸，呈阳性反应。

1.4.6吲哚试验将菌种接种于试管装的蛋白胨水溶液培养基中，37 ℃下培养4 d以上，在培养基中加入1～2 mL乙醚，轻摇，静置3 min，再沿试管壁缓慢滴入3～5滴乙醚（此时不可摇动），观察反应，若乙醚层呈现红色则为阳性反应。

1.4.7过氧化氢酶测定取少量菌液涂抹于已滴有5% H2O2的培养皿上，如立即产生气泡则为阳性，反之为阴性。

1.4.8葡萄糖产酸将葡萄糖蛋白胨水溶液装入试管 115 ℃ 灭菌30 min，把试验菌株接种于灭菌后的培养液中，在28 ℃恒温状态下培养5 d，加入5滴40%KOH后，再加入等量5%α-萘酚，振荡后于37 ℃培养箱中静置30 min后观察。若试管中物体呈红色，则其反应为阳性。endprint

1.5固氮酶活性测定

固氮酶不但能将分子氮还原为氨，还可以催化一些具有N—N、NO、C≡N以及C≡C键化合物的还原，固氮酶可还原乙炔（C2H2）形成乙烯（C2H4），采用气象色谱仪可快速测定固氮酶的乙炔还原活性。

将待测菌接种于50 mL三角瓶内的无氮培养基中，用封口膜密封在28 ℃恒温条件下培养1 d，再用无菌胶塞密封瓶口。用无菌注射器抽出5 mL气体，再注入等量乙炔气体，继续培养3 d，抽取1 mL气样，在气相色谱仪中测定乙炔还原活性，以1 h、1 mL培养物产生的乙烯量表示固氮酶的活性。

乙炔还原活性=实际乙烯峰值×标准乙烯浓度×试管容积24.9×标准乙烯峰值×样品培养时间。

式中：24.9为常数，乙炔还原活性即产生的乙烯浓度[nmol/（h·mL）]。

2结果与分析

2.1不同作物根际自生固氮菌数量分布

自生固氮菌适宜生长的温度为28～30 ℃，在中性土壤中自生固氮菌会大量增殖。本研究采用平板计数法统计样品自生固氮菌数量，结果见表1。适宜的稀释度为10-4、10-5、10-6，本研究选取10-5 稀释度进行计数。不同作物根际自生固氮菌数量不尽相同，油菜、玉米根际的自生固氮菌数量远大于小麦、青稞。对菌种进行分离分别得到 19株自生固氮菌。

3结论

分离筛选了不同作物根际土壤自生固氮菌，对其形态特征和理化性质进行鉴定，并用乙炔还原法测定固氮能力。结果表明，在分离出的19株菌种中，油菜根际的自生固氮菌数量最多，且固氮酶活性较好，根据文献[6]，结合菌株的形态学特征及部分生理生化反应特征，将从油菜根际分离的高效固氮菌株（油菜4）初步鉴定为德克斯氏菌属（Derxia spp.）。本研究根据乙炔还原法筛选出各样地固氮效果最好的菌株，为下一步的跟踪研究及开发利用提供基础。

自生固氮菌在土壤耕层分布较多，作物根际的自生固氮菌可通过固氮酶作用为作物提供氮素营养，对提高作物产量具有一定作用，同时这类菌种还可产生大量植物激素，从而影响植物生理过程以促进植物生长。本研究筛选的具有高效固氮能力的菌株可继续进行盆栽试验，以期为作物肥效试验奠定基础，并为微生物菌体研究提供依据。

参考文献：

[1]陈今朝，向邓云. 生物固氮的研究与应用[J]. 涪陵师专学报，2000，16（2）：93-96.

[2]葛诚. 微生物肥料概述[J]. 土壤肥料，1993（6）：43-46.

[3]陈文新，李阜棣，闫章才. 我国土壤微生物学和生物固氮研究的回顾与展望[J]. 世界科技研究与发展，2002，24（4）：6-12.

[4]李华，陈万仁，王光龙. 生物固氮的研究与发展[J]. 郑州工业大学学报，1997，18（3）：92-94.

[5]丁延芹，王建平，刘元，等. 几株固氮芽孢杆菌的分离与鉴定[J]. 农业生物技术学报，2004，12（6）：690-697.

[6]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001：353-370.endprint

1.5固氮酶活性测定

固氮酶不但能将分子氮还原为氨，还可以催化一些具有N—N、NO、C≡N以及C≡C键化合物的还原，固氮酶可还原乙炔（C2H2）形成乙烯（C2H4），采用气象色谱仪可快速测定固氮酶的乙炔还原活性。

将待测菌接种于50 mL三角瓶内的无氮培养基中，用封口膜密封在28 ℃恒温条件下培养1 d，再用无菌胶塞密封瓶口。用无菌注射器抽出5 mL气体，再注入等量乙炔气体，继续培养3 d，抽取1 mL气样，在气相色谱仪中测定乙炔还原活性，以1 h、1 mL培养物产生的乙烯量表示固氮酶的活性。

乙炔还原活性=实际乙烯峰值×标准乙烯浓度×试管容积24.9×标准乙烯峰值×样品培养时间。

式中：24.9为常数，乙炔还原活性即产生的乙烯浓度[nmol/（h·mL）]。

2结果与分析

2.1不同作物根际自生固氮菌数量分布

自生固氮菌适宜生长的温度为28～30 ℃，在中性土壤中自生固氮菌会大量增殖。本研究采用平板计数法统计样品自生固氮菌数量，结果见表1。适宜的稀释度为10-4、10-5、10-6，本研究选取10-5 稀释度进行计数。不同作物根际自生固氮菌数量不尽相同，油菜、玉米根际的自生固氮菌数量远大于小麦、青稞。对菌种进行分离分别得到 19株自生固氮菌。

3结论

分离筛选了不同作物根际土壤自生固氮菌，对其形态特征和理化性质进行鉴定，并用乙炔还原法测定固氮能力。结果表明，在分离出的19株菌种中，油菜根际的自生固氮菌数量最多，且固氮酶活性较好，根据文献[6]，结合菌株的形态学特征及部分生理生化反应特征，将从油菜根际分离的高效固氮菌株（油菜4）初步鉴定为德克斯氏菌属（Derxia spp.）。本研究根据乙炔还原法筛选出各样地固氮效果最好的菌株，为下一步的跟踪研究及开发利用提供基础。

自生固氮菌在土壤耕层分布较多，作物根际的自生固氮菌可通过固氮酶作用为作物提供氮素营养，对提高作物产量具有一定作用，同时这类菌种还可产生大量植物激素，从而影响植物生理过程以促进植物生长。本研究筛选的具有高效固氮能力的菌株可继续进行盆栽试验，以期为作物肥效试验奠定基础，并为微生物菌体研究提供依据。

参考文献：

[1]陈今朝，向邓云. 生物固氮的研究与应用[J]. 涪陵师专学报，2000，16（2）：93-96.

[2]葛诚. 微生物肥料概述[J]. 土壤肥料，1993（6）：43-46.

[3]陈文新，李阜棣，闫章才. 我国土壤微生物学和生物固氮研究的回顾与展望[J]. 世界科技研究与发展，2002，24（4）：6-12.

[4]李华，陈万仁，王光龙. 生物固氮的研究与发展[J]. 郑州工业大学学报，1997，18（3）：92-94.

[5]丁延芹，王建平，刘元，等. 几株固氮芽孢杆菌的分离与鉴定[J]. 农业生物技术学报，2004，12（6）：690-697.

[6]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001：353-370.endprint

1.5固氮酶活性测定

固氮酶不但能将分子氮还原为氨，还可以催化一些具有N—N、NO、C≡N以及C≡C键化合物的还原，固氮酶可还原乙炔（C2H2）形成乙烯（C2H4），采用气象色谱仪可快速测定固氮酶的乙炔还原活性。

将待测菌接种于50 mL三角瓶内的无氮培养基中，用封口膜密封在28 ℃恒温条件下培养1 d，再用无菌胶塞密封瓶口。用无菌注射器抽出5 mL气体，再注入等量乙炔气体，继续培养3 d，抽取1 mL气样，在气相色谱仪中测定乙炔还原活性，以1 h、1 mL培养物产生的乙烯量表示固氮酶的活性。

乙炔还原活性=实际乙烯峰值×标准乙烯浓度×试管容积24.9×标准乙烯峰值×样品培养时间。

式中：24.9为常数，乙炔还原活性即产生的乙烯浓度[nmol/（h·mL）]。

2结果与分析

2.1不同作物根际自生固氮菌数量分布

自生固氮菌适宜生长的温度为28～30 ℃，在中性土壤中自生固氮菌会大量增殖。本研究采用平板计数法统计样品自生固氮菌数量，结果见表1。适宜的稀释度为10-4、10-5、10-6，本研究选取10-5 稀释度进行计数。不同作物根际自生固氮菌数量不尽相同，油菜、玉米根际的自生固氮菌数量远大于小麦、青稞。对菌种进行分离分别得到 19株自生固氮菌。

3结论

分离筛选了不同作物根际土壤自生固氮菌，对其形态特征和理化性质进行鉴定，并用乙炔还原法测定固氮能力。结果表明，在分离出的19株菌种中，油菜根际的自生固氮菌数量最多，且固氮酶活性较好，根据文献[6]，结合菌株的形态学特征及部分生理生化反应特征，将从油菜根际分离的高效固氮菌株（油菜4）初步鉴定为德克斯氏菌属（Derxia spp.）。本研究根据乙炔还原法筛选出各样地固氮效果最好的菌株，为下一步的跟踪研究及开发利用提供基础。

自生固氮菌在土壤耕层分布较多，作物根际的自生固氮菌可通过固氮酶作用为作物提供氮素营养，对提高作物产量具有一定作用，同时这类菌种还可产生大量植物激素，从而影响植物生理过程以促进植物生长。本研究筛选的具有高效固氮能力的菌株可继续进行盆栽试验，以期为作物肥效试验奠定基础，并为微生物菌体研究提供依据。

参考文献：

[1]陈今朝，向邓云. 生物固氮的研究与应用[J]. 涪陵师专学报，2000，16（2）：93-96.

[2]葛诚. 微生物肥料概述[J]. 土壤肥料，1993（6）：43-46.

[3]陈文新，李阜棣，闫章才. 我国土壤微生物学和生物固氮研究的回顾与展望[J]. 世界科技研究与发展，2002，24（4）：6-12.

[4]李华，陈万仁，王光龙. 生物固氮的研究与发展[J]. 郑州工业大学学报，1997，18（3）：92-94.

[5]丁延芹，王建平，刘元，等. 几株固氮芽孢杆菌的分离与鉴定[J]. 农业生物技术学报，2004，12（6）：690-697.

[6]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001：353-370.endprint