木霉菌液体发酵对秸秆的降解作用

屈海泳　刘连妹　吴纯

摘要：以小麦秸秆为唯一碳源，从发酵液中一代一代提取木霉菌，通过测定秸秆降解率，残余秸秆有机质含量，发酵液中氮、磷、钾含量，研究木霉菌对秸秆的降解作用。结果表明：通过一代一代的从发酵液中提取木霉菌，其降解能力有所提高，提取到第4代时，降解能力最高，第4代后，木霉菌的降解能力下降。

关键词：木霉菌；液体发酵；秸秆；纤维素降解

中图分类号： S141.4 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0283-02

收稿日期：2013-07-17

基金项目：江苏省黄河故道农业资源开发项目。

作者简介：屈海泳（1972—），男，安徽宿州人，博士，副教授，从事园艺生理学研究。Tel：（0517）83591025；E-mail：quhaiyong@126.com。农作物秸秆是农业生产的副产品。近年来，随着农村经济的发展，传统的秸秆利用方式逐渐被弱化和淘汰，大量剩余秸秆的处理成为农业生产中凸显的问题，一些农民采取最简单的处理方式——焚烧或随意堆弃，这样既污染了环境，又浪费了资源。据报道，我国年产各类农作物秸秆达6.5亿t，占世界秸秆总产量的20%～30%[1]。目前，有效利用率只占50%，其余部分大多被付之一炬，造成了大量的社会、经济和生态问题，成为政府关心、社会关注的热点和难点。充分合理地利用秸秆是农业生产面临的一个难题。近几十年来，国内外一直在探索利用物理、化学和生物方法来降解农作物秸秆，其中采用微生物来降解秸秆被认为是一种简单、经济、有效的方法，可克服机械粉碎法、热处理法[2]、化学处理法的不足，成为秸秆降解领域的研究热点[3]。自然界中，许多细菌、放线菌和真菌能分解纤维素。秸秆中的纤维素含量占绝大部分，想要有效降解秸秆，先要有效分解其中的纤维素。真菌降解纤维素已得到广泛认可，已报道的对纤维素作用较强的菌株多是木霉属、曲霉属、青霉属、枝顶孢霉属、漆斑霉属的。由于木霉属真菌能分泌完整的纤维素酶系，可完全水解天然纤维素，所以有关专家更倾向研究木霉。姚强用液体摇瓶法从碱性土壤中筛选到降解纤维素的哈茨木霉[4]。木霉菌属真菌门，广泛存在于不同环境条件下的土壤中。木霉在生物防治上的抑菌防病特性及其在有机污染生物修复上的作用，使得木霉的研究引起重视。本试验通过木霉菌液体发酵促进秸秆的降解，由于直接从田间分离或实验室保存的木霉菌存在着菌种退化现象，达不到理想降解秸秆的目的，所以笔者希望通过一代接着一代的发酵培养，提高木霉菌对秸秆的降解能力。

1材料与方法

1.1材料

试验菌种：木霉菌实验室筛选保藏，PDA培养基，孟加拉红培养基，pH值均自然，121 ℃、0.1 MPa高压灭菌30 min。

秸秆样品：小麦秸秆来源于农户，风干，剪成2～3 cm，经粉碎机粉碎成过40目左右的秸秆粉，烘干至恒重。

1.2主要仪器与设备

超净工作台、自动电热压力蒸汽灭菌锅、电子分析天平、恒温摇床、恒温培养箱、电热恒温鼓风干燥箱、微型植物粉碎机、可见分光光度计、火焰光度计、扩散皿、微量滴定管。

1.3方法

1.3.1菌种培养取置于实验室冰箱中的木霉菌，接种到固体培养基上进行种子活化，置于28 ℃恒温培养箱中培养7 d。

1.3.2孢子液配制取培养5 d的木霉菌平板，加入5 mL无菌水将孢子刮下，取100 μL此悬液，加蒸馏水稀释一定倍数，在600 nm下测其吸光度，根据吸光度加入适量无菌水稀释调节至同一水平，备用。

1.3.3秸秆发酵培养取5个250 mL锥形瓶，分别称取2 g小麦秸秆粉末置于其中，再加入60 mL蒸馏水，混匀，经 121 ℃ 高温灭菌20 min，待其冷却，调节pH值为6，然后用移液枪接种上述1 mL孢子液置于其中4个锥形瓶中，剩下一个作为空白不接种孢子液，置于30 ℃、 120 r/min的恒温摇床下发酵培养7 d。发酵结束，用移液枪移取100 μL此发酵液，均匀涂于平板上，置于上述相同环境下培养，将第1次从发酵液中提取出培养的菌称为1代菌；将锥形瓶充分摇匀，取适量发酵液，待测定其中养分含量。再次取5个上述相同容量锥形瓶，加入同样质量的新的秸秆和蒸馏水，相同处理，将1代菌种接入其中发酵培养，如此一直继代培养，依次将得到2、3、4、5、6代菌，以冰箱中取出的木霉菌作为对照。

1.3.4测定项目与方法发酵结束后残余秸秆有机质含量的测定采用K2Cr2O7-H2SO4外加热法；发酵液中氮含量（以铵态氮含量计，下同）的测定采用碱解扩散法；发酵液中磷含量的测定采用钼酸铵-分光光度法；发酵液中钾含量的测定采用火焰光度计测定法；秸秆降解率的测定：将降解过的秸秆粉过滤冲洗，除去菌体，105 ℃烘干至恒重，以不接菌的为对照，失重法计算秸秆降解率。

1.3.5数据处理数据处理与统计分析用Excel 2003和SPSS软件进行。

2结果与分析

2.1秸秆发酵前后颜色变化

经高温灭菌后，于锥形瓶中接种1 mL孢子液，结果（图1-A）发现，该锥形瓶中上层溶液具有一定透明度，且颜色呈红棕色。发酵后7 d（图1-b），静置一段时间后发现，该发酵样品的上层溶液颜色变成土黄色，且溶液浑浊。与加入木霉菌溶液相比，对照（不加木霉菌）上层溶液仍具有一定透明度，浑浊度相对较低。

2.2各代木霉菌对秸秆降解率的影响

从表1可以看出，木霉菌液体发酵对秸秆的降解具有一定的显著效果，只是各代菌种的降解效果不同。从发酵液中提取出的木霉菌降解效果显著好于对照，当提取到第3、第4代时，其降解率到达最大，为19.35%；再提取到第5、第6代时，其降解率略有下降，其中6代菌下降最明显。

3结论与讨论endprint

本试验采用木霉菌降解秸秆，秸秆在发酵7 d之后，量均有减少，说明木霉菌能有效降解秸秆。其中，3、4代菌的降解率较高，比对照高6.99%，通过一代一代的从发酵液中提取木霉菌，提高了秸秆降解能力，但也不是次数越多越好，当提取到第5代时，秸秆降解率略有下降，到第6代时下降更明显。从本试验结果可知木霉菌提取一定次数后，其降解能力会下降，这与杨小丽的试验结果[6]类似，通过对菌种一直继代培养，淘汰培养过程中降解能力下降的菌株，选择降解能力强的菌株。卢松通过研究微生物对玉米秸秆的腐解，得出秸秆的发酵过程是有机质不断分解的过程的结论[7]，与本研究结果一致，即有机质含量变化与秸秆降解率变化基本一致。

通过具体分析各代菌发酵液中氮、磷、钾含量的变化趋势可以得出，整体养分含量通过对木霉菌的多次提取有所提高，提高的趋势虽不同，但是当提取到第4代时各养分含量都达到最大值，分别为89.95、49.29、134.26 mg/L。与对照相比，养分含量分别提高了31.75、12.26、31.53 mg/L，但是当继续提取下去时，各养分含量均略有下降，与秸秆降解率的变化趋势相同。本研究结合各养分含量与秸秆降解率的变化趋势得出，4代菌的降解率最高，且其各养分含量均达到最高。

参考文献：

[1]曹玉凤，李英，刘荣昌，等. 生物技术在处理农作物秸秆饲料中的应用[J]. 饲料研究，1999，22（1）：27-28.

[2]杨雪霞，陈洪章，李佐虎. 玉米秸秆氨化汽爆处理及其固态发酵[J]. 过程工程学报，2001，1（1）：86-89.

[3]王淑军，扬从发，陈静. 用于降解秸秆的纤维素酶产生菌的筛选研究[J]. 粮食与饲料工业，2001（12）：21-23.

[4]姚强，黄琰，陈冠军. 哈茨木霉SDU3.87耐碱性纤维素酶液体发酵条件的研究[J]. 山东大学学报：理学版，2005，40（3）：110-115.

[5]史央，戴传超，吴耀春，等. 植物内生真菌强化还田秸秆降解的研究[J]. 环境科学学报，2004，24（1）：144-149.

[6]杨小丽. 秸秆降解菌的选育及复配研究[D]. 郑州：郑州大学，2009.

[7]卢松. 微生物处理玉米秸秆的腐解特征研究[D]. 重庆：西南大学，2010.endprint

本试验采用木霉菌降解秸秆，秸秆在发酵7 d之后，量均有减少，说明木霉菌能有效降解秸秆。其中，3、4代菌的降解率较高，比对照高6.99%，通过一代一代的从发酵液中提取木霉菌，提高了秸秆降解能力，但也不是次数越多越好，当提取到第5代时，秸秆降解率略有下降，到第6代时下降更明显。从本试验结果可知木霉菌提取一定次数后，其降解能力会下降，这与杨小丽的试验结果[6]类似，通过对菌种一直继代培养，淘汰培养过程中降解能力下降的菌株，选择降解能力强的菌株。卢松通过研究微生物对玉米秸秆的腐解，得出秸秆的发酵过程是有机质不断分解的过程的结论[7]，与本研究结果一致，即有机质含量变化与秸秆降解率变化基本一致。

通过具体分析各代菌发酵液中氮、磷、钾含量的变化趋势可以得出，整体养分含量通过对木霉菌的多次提取有所提高，提高的趋势虽不同，但是当提取到第4代时各养分含量都达到最大值，分别为89.95、49.29、134.26 mg/L。与对照相比，养分含量分别提高了31.75、12.26、31.53 mg/L，但是当继续提取下去时，各养分含量均略有下降，与秸秆降解率的变化趋势相同。本研究结合各养分含量与秸秆降解率的变化趋势得出，4代菌的降解率最高，且其各养分含量均达到最高。

参考文献：

[1]曹玉凤，李英，刘荣昌，等. 生物技术在处理农作物秸秆饲料中的应用[J]. 饲料研究，1999，22（1）：27-28.

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[5]史央，戴传超，吴耀春，等. 植物内生真菌强化还田秸秆降解的研究[J]. 环境科学学报，2004，24（1）：144-149.

[6]杨小丽. 秸秆降解菌的选育及复配研究[D]. 郑州：郑州大学，2009.

[7]卢松. 微生物处理玉米秸秆的腐解特征研究[D]. 重庆：西南大学，2010.endprint

本试验采用木霉菌降解秸秆，秸秆在发酵7 d之后，量均有减少，说明木霉菌能有效降解秸秆。其中，3、4代菌的降解率较高，比对照高6.99%，通过一代一代的从发酵液中提取木霉菌，提高了秸秆降解能力，但也不是次数越多越好，当提取到第5代时，秸秆降解率略有下降，到第6代时下降更明显。从本试验结果可知木霉菌提取一定次数后，其降解能力会下降，这与杨小丽的试验结果[6]类似，通过对菌种一直继代培养，淘汰培养过程中降解能力下降的菌株，选择降解能力强的菌株。卢松通过研究微生物对玉米秸秆的腐解，得出秸秆的发酵过程是有机质不断分解的过程的结论[7]，与本研究结果一致，即有机质含量变化与秸秆降解率变化基本一致。

通过具体分析各代菌发酵液中氮、磷、钾含量的变化趋势可以得出，整体养分含量通过对木霉菌的多次提取有所提高，提高的趋势虽不同，但是当提取到第4代时各养分含量都达到最大值，分别为89.95、49.29、134.26 mg/L。与对照相比，养分含量分别提高了31.75、12.26、31.53 mg/L，但是当继续提取下去时，各养分含量均略有下降，与秸秆降解率的变化趋势相同。本研究结合各养分含量与秸秆降解率的变化趋势得出，4代菌的降解率最高，且其各养分含量均达到最高。

参考文献：

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[3]王淑军，扬从发，陈静. 用于降解秸秆的纤维素酶产生菌的筛选研究[J]. 粮食与饲料工业，2001（12）：21-23.

[4]姚强，黄琰，陈冠军. 哈茨木霉SDU3.87耐碱性纤维素酶液体发酵条件的研究[J]. 山东大学学报：理学版，2005，40（3）：110-115.

[5]史央，戴传超，吴耀春，等. 植物内生真菌强化还田秸秆降解的研究[J]. 环境科学学报，2004，24（1）：144-149.

[6]杨小丽. 秸秆降解菌的选育及复配研究[D]. 郑州：郑州大学，2009.

[7]卢松. 微生物处理玉米秸秆的腐解特征研究[D]. 重庆：西南大学，2010.endprint