人工模拟干旱胁迫下金银花幼苗的生理适应性反应

黄海疆++++++贺兰云

[摘要] 目的 研究人工模拟干旱胁迫条件下金银花幼苗的生理适应性反应，为揭示金银花植株的抗旱机制以及抗旱品种的选育提供理论依据。 方法 采用聚乙二醇（PEG-6000）模拟干旱胁迫处理金银花幼苗，检测幼苗体内的丙二醛（MDA）含量；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）等保护酶活性，渗透调节物质脯氨酸（Pro）和可溶性糖含量。 结果 10%、20%和30%PEG处理幼苗后120 h MDA含量分别高出对照组20.31%、28.12%和36.72%，随着PEG浓度升高，MDA含量逐渐增加。SOD、POD、CAT和APX活性总体呈现先升高后降低的趋势，各种酶对干旱胁迫的响应速率不同，CAT于干旱胁迫后立即开始启动，SOD、POD于干旱胁迫后24 h启动，而APX于干旱胁迫后48 h开始启动。Pro和可溶性糖含量均于处理后24 h开始增高，于处理后72 h达到峰值。 结论 随着干旱程度的增加和胁迫的延长，金银花体内膜质过氧化严重，通过增加Pro、可溶性糖的含量以及保护酶系统来抵御干旱胁迫，保护酶启动顺序为CAT、SOD、POD、APX。

[关键词] 金银花；聚乙二醇（PEG-6000）；丙二醛；脯氨酸；可溶性糖；保护酶

[中图分类号] Q786 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）07（a）-0012-04

金银花（Lonicera japonica Thunb）源于忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花，性寒，味甘，具有清热解毒、凉散风热之功效[1]，是中医临床常用药材，也是重要的出口品种。目前金银花年需求量超过2000万公斤，种植面积不断扩大。河南是金银花主产区，春季干旱是金银花最易遭受的胁迫之一，提高金银花植株的抗旱性及抗旱品种选育是目前金银花生产面临的重要问题，目前关于金银花抗旱机制的研究尚不深入。

聚乙二醇（PEG）是一种高分子渗透剂，可限制水分被植物吸收的速率[2]，是目前模拟干旱胁迫常用的材料之一[3]。本试验采用PEG人工模拟水分胁迫，测定不同浓度干旱胁迫下金银花幼苗体内的丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）等保护酶活性；脯氨酸和可溶性糖含量的动态变化，揭示金银花幼苗应对干旱胁迫逆境时的生理适应性反应，为金银花植株耐旱机制研究以及抗旱品种选育提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料前期准备

金银花种子采自河北金银花基地，选取颗粒饱满、大小一致的金银花种子，用10%的H2O2消毒10 min，然后用去离子水清洗3～4次，播种后置于（25±1）℃的气候箱（硕联SRG-260A）内避光进行金银花种子的萌发，待出苗后，使用1/2 Hoagland营养液进行浇灌培养。培养条件：25℃昼/20℃夜，每日光照时长14 h，光强280～350 μm·m-2s-1，气候箱内相对湿度设置为65%～70%。

1.2 PEG胁迫处理

选取长势良好大小一致的金银花幼苗，移栽于水培罐中，用Hoagland完全营养液培养，每3天更换1次营养液，预培2周后进行干旱处理。将PEG-6000（科密欧试剂，分析纯）用Hoagland营养液分别配制成10%、20%和30%的溶液，对照组（CK）用不含PEG-6000的Hoagland营养液培养。胁迫后0 d， 24、48、72、96、120 h后分别取样检测幼苗体内的MDA含量、渗透调节物质（脯氨酸、可溶性糖）的含量、保护酶（SOD、POD、CAT、APX）活性，由于酶有不稳定性，每次试验设6个独立重复。

1.3 测定与方法

1.3.1 MDA含量的测定方法 硫代巴比妥酸（TBA）法[4]。

1.3.2 脯氨酸含量的测定方法 茚三酮比色法[5]。

1.3.3 可溶性糖含量的测定方法 蒽酮法[6]。

1.3.4 保护酶活性的测定方法 联苯三酚自氧化法[7]测定SOD活性，以1 ml反应液中，每分钟抑制联苯三酚自氧化达50%的酶量定义为1个酶单位，酶的活性用U/mg蛋白表示；愈创木酚比色法[8]测定POD活性，1个POD活性单位（U）为每分钟内使A470变化0.01的酶量，酶活性以U/mg蛋白表示；紫外吸收法[9]测定CAT活性，以1 min内A240降低0.1的酶量为1个酶活性单位（U），酶活性以U/mg蛋白表示；APX活性的测定采用紫外分光光度法[10]，1个APX酶活性单位（U）为每分钟使A290变化0.01的酶量，酶活性以U/mg蛋白表示。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人工模拟干旱胁迫条件下金银花幼苗体内MDA含量的动态变化

随着干旱胁迫时间的增加，金银花幼苗体内的MDA含量逐渐上升。10%、20%和30%PEG处理后MDA含量变化趋势相似。不同浓度的PEG处理后24 h MDA含量较对照组略微下降，值分别为3.12%（10%PEG）、1.56%（20%PEG）、1.56%（30%PEG）。PEG处理后72 h 金银花幼苗体内的MDA含量均持续上升，10%PEG处理后72、96、120 h MDA含量与对照组比较分别高出6.25%、15.75%和20.31%；20%PEG处理后分别高出对照组6.25%（10%PEG）、17.32%（20%PEG）和28.12%（30%PEG）；30%PEG处理后分别高出对照20.31%（10%PEG）、18.89%（20%PEG）和36.72%（30%PEG）（图1）。

图1 PEG模拟干旱胁迫对金银花幼苗体内MDA含量的影响

2.2人工模拟干旱胁迫下金银花幼苗体内渗透调节物质的含量变化

不同程度干旱胁迫后24 h植物体内的可溶性糖含量显著提高，胁迫后含量72 h达到峰值，而后缓慢下降，表明金银花幼苗体内的可溶性糖调节机制于干旱胁迫后24 h启动，随着胁迫程度超出机体耐受程度，体内合成可溶性糖的系统遭到破坏，幼苗体内可溶性糖的含量开始缓慢下降（图2A）。不同程度PEG处理后金银花幼苗体内的脯氨酸含量变化趋势相似，均于胁迫后24 h开始升高，于72 h达到顶峰而后下降（图2B）。

图2 PEG模拟干旱胁迫对金银花幼苗体内渗透调节物质含量的影响

2.3 人工模拟干旱胁迫下金银花幼苗体内保护酶活性的变化

不同程度的干旱胁迫条件下，植物体内SOD 活性总体呈现出先增高后降低的趋势。10%PEG和20%PEG干旱胁迫后24 h SOD活性逐渐升高，于处理后72 h达到最大值，分别较对照组提高33.7%和41.2%。30%PEG干旱胁迫后24 h SOD活性上升，胁迫后24～96 h活性比较稳定，96 h后显著下降（图3A）。

10%PEG和30%PEG处理后金银花体内的POD 活性均出现先升高后下降的过程，其活性最大值分别出现在胁迫后48、72 h。20%PEG处理后POD活性处于相对平缓的状态（图3B）。

不同程度干旱胁迫后金银花幼苗体内的CAT活性变化趋势相似，即于干旱胁迫初期显著升高，均在处理后48 h达到峰值，分别高于对照组23.98%（10%PEG）、25.54%（20%PEG）和21.18%（30%PEG），处理后120 h达到最低值（图3C）。

APX活性于干旱胁迫初期无明显变化，干旱胁迫后48h APX活性出现升高趋势，分别写胁迫后96h（10%PEG）、96h（20%PEG）和72h（30%PEG）达到峰值（图3D）。

3 讨论

通常情况下植物细胞内自由基含量处于动态平衡中，当有逆境出现时过剩的自由基会导致膜内脂双分子层中所含的不饱和脂肪酸发生氧化分解，造成细胞膜破坏，增加细胞膜的透性。MDA为脂质过氧化产物，其含量高低可反映膜损伤程度[11]。从金银花幼苗体内的MDA变化情况来看，干旱胁迫初期金银花体内的MDA含量降低，暗示金银花在应对干旱胁迫时的避旱反应，而胁迫后72 h MDA含量逐渐增加，表明随着干旱程度的增加和胁迫的延长，细胞内发生了膜脂的过氧化反应，而且干旱程度越高，细胞膜系统的损伤程度越高。

脯氨酸是植物体内一种重要的小分子渗透物质，脯氨酸含量的多少直接关系到植物抗逆性的强弱[12]。可溶性糖也是植物体内的一种重要的渗透调节剂，水分渗透胁迫下植物体可通过提高可溶性糖的含量来抵御干旱胁迫[13-14]。调节物质变化情况表明金银花幼苗在受到干旱胁迫24 h后，可溶性糖的合成机制开始启动，于胁迫后72 h合成量达到顶峰。上述结果表明金银花幼苗于胁迫后24 h启动体内脯氨酸和可溶性糖的代谢机制来抵御外界干旱胁迫。

SOD对维持·O2-的平衡起重要的作用，是生物保护酶系统的重要成员[15]。从干旱胁迫下活性酶变的化情况来看，低度干旱胁迫和中度干旱胁迫下SOD活性不断升高，消除体内过剩的自由基，维持机体环境的平衡，而在重度干旱胁迫下SOD也于24 h启动，当干旱程度超过机体耐受限度时SOD活性急剧下降。

POD是植物体内防御活性氧伤害的主要酶类之一[16]。CAT能分解细胞代谢过程中产生的过氧化氢，以避免过氧化氢在生物体内产生毒性作用[17]。APX可以通过清除活性氧而保护细胞免于伤害[18]。实验结果表明，干旱胁迫下金银花体内的CAT活性升高的起始时间较SOD和POD要早，也就是说干旱胁迫下金银花先启动CAT酶来抵御干旱胁迫，当干旱程度超出机体的耐受能力时，CAT活性逐渐下降。

结合各种保护酶的生理生化特性及金银花体内这4种酶活性的动态变化来看，不同程度的干旱胁迫这4种保护酶对干旱胁迫的响应速率不同，金银花首先启动CAT活性，分解植物体内代谢产生的H2O2，其次启动SOD活性，将·O2-歧化为H2O2。POD与SOD酶同时启动将O2催化还原为·O2-，最后启动APX，它可以辅助清除H2O2等活性氧。

[参考文献]

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典·一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：205-206.

[2] 李季平，古红梅，吴诗光，等.聚乙二醇（PEG）处理对小麦萌发种子生理生化特性的影响[J].河南农业科学，2002， 31（6）：4-6.

[3] 龚子端，李高阳.PEG干旱胁迫对植物的影响[J].河南林业科技，2006，26（3）：21.

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[5] 上海植物生理学会.植物生理学实验手册[M].上海：上海科技出版社，1985：303，305，314.

[6] 刘海英，王华华，崔长海，等.可溶性糖含量测定（蒽酮法）实验的改进[J].实验室科学，2013，16（2）：19，20.

[7] 柳林，王艳.常绿植物SOD活性与植物耐寒力相关性的研究[J].安康师专学报，2001，13（2）：47-49.

[8] Bai BZ，Sun CH，Tian WX.Experimental Mannual of Plant Physiology[M].2nd.Beijing：Chinese Agricultural Press，1998：79-81，107-108.

[9] 高俊凤.植物生理学实验技术[M].西安：世界图书出版公司，2000：194.

[10] 曹慧，王孝威，曹琴，等.水分胁迫下新红星苹果超氧物自由基累积和膜脂过氧化作用[J].果树学报，2001，18（4）：196-199.

[11] 孙伟泽，韩博，胡晓宁，等.不同浓度盐胁迫下苜蓿丙二醛含量变化[J].安徽农业科学，2009，37（5）：1905-1906.

[12] 赵瑞雪，朱慧森，程钰宏，等.植物脯氨酸及其合成酶系研究进展[J].草业科学，2008，25（2）：90-96.

[13] Bell JE，Bell ET.Proteins and enzyme[Z].Prentice-Hall，Inc，1988.

[14] 诺顿.植物蛋白[M].北京：科学出版社，1983.

[15] 孙黎，肖璐，阎平，等.藜科12种盐生植物SOD活性及其同工酶的初步研究[J].石河子大学学报，2004，22（6）：500-503.

[16] 孙存华，李扬，贺鸿雁，等.藜对干旱胁迫的生理生化反应[J].生态学报，2005，25（10）：2556-2560.

[17] 李宏文，史绮，曹阳，等.紫外光对几种水生植物过氧化氢酶（CAT）活性的影响[J].环境科学，1993，4（14）：74-77.

[18] 王超，杨传平，王玉成.白桦抗坏血酸过氧化物酶（APX）基因克隆及表达分析[J].东北林业大学学报，2009，37（3）：79-81.

（收稿日期：2014-05-21 本文编辑：许俊琴）

图1 PEG模拟干旱胁迫对金银花幼苗体内MDA含量的影响

2.2人工模拟干旱胁迫下金银花幼苗体内渗透调节物质的含量变化

不同程度干旱胁迫后24 h植物体内的可溶性糖含量显著提高，胁迫后含量72 h达到峰值，而后缓慢下降，表明金银花幼苗体内的可溶性糖调节机制于干旱胁迫后24 h启动，随着胁迫程度超出机体耐受程度，体内合成可溶性糖的系统遭到破坏，幼苗体内可溶性糖的含量开始缓慢下降（图2A）。不同程度PEG处理后金银花幼苗体内的脯氨酸含量变化趋势相似，均于胁迫后24 h开始升高，于72 h达到顶峰而后下降（图2B）。

图2 PEG模拟干旱胁迫对金银花幼苗体内渗透调节物质含量的影响

2.3 人工模拟干旱胁迫下金银花幼苗体内保护酶活性的变化

不同程度的干旱胁迫条件下，植物体内SOD 活性总体呈现出先增高后降低的趋势。10%PEG和20%PEG干旱胁迫后24 h SOD活性逐渐升高，于处理后72 h达到最大值，分别较对照组提高33.7%和41.2%。30%PEG干旱胁迫后24 h SOD活性上升，胁迫后24～96 h活性比较稳定，96 h后显著下降（图3A）。

10%PEG和30%PEG处理后金银花体内的POD 活性均出现先升高后下降的过程，其活性最大值分别出现在胁迫后48、72 h。20%PEG处理后POD活性处于相对平缓的状态（图3B）。

不同程度干旱胁迫后金银花幼苗体内的CAT活性变化趋势相似，即于干旱胁迫初期显著升高，均在处理后48 h达到峰值，分别高于对照组23.98%（10%PEG）、25.54%（20%PEG）和21.18%（30%PEG），处理后120 h达到最低值（图3C）。

APX活性于干旱胁迫初期无明显变化，干旱胁迫后48h APX活性出现升高趋势，分别写胁迫后96h（10%PEG）、96h（20%PEG）和72h（30%PEG）达到峰值（图3D）。

3 讨论

通常情况下植物细胞内自由基含量处于动态平衡中，当有逆境出现时过剩的自由基会导致膜内脂双分子层中所含的不饱和脂肪酸发生氧化分解，造成细胞膜破坏，增加细胞膜的透性。MDA为脂质过氧化产物，其含量高低可反映膜损伤程度[11]。从金银花幼苗体内的MDA变化情况来看，干旱胁迫初期金银花体内的MDA含量降低，暗示金银花在应对干旱胁迫时的避旱反应，而胁迫后72 h MDA含量逐渐增加，表明随着干旱程度的增加和胁迫的延长，细胞内发生了膜脂的过氧化反应，而且干旱程度越高，细胞膜系统的损伤程度越高。

脯氨酸是植物体内一种重要的小分子渗透物质，脯氨酸含量的多少直接关系到植物抗逆性的强弱[12]。可溶性糖也是植物体内的一种重要的渗透调节剂，水分渗透胁迫下植物体可通过提高可溶性糖的含量来抵御干旱胁迫[13-14]。调节物质变化情况表明金银花幼苗在受到干旱胁迫24 h后，可溶性糖的合成机制开始启动，于胁迫后72 h合成量达到顶峰。上述结果表明金银花幼苗于胁迫后24 h启动体内脯氨酸和可溶性糖的代谢机制来抵御外界干旱胁迫。

SOD对维持·O2-的平衡起重要的作用，是生物保护酶系统的重要成员[15]。从干旱胁迫下活性酶变的化情况来看，低度干旱胁迫和中度干旱胁迫下SOD活性不断升高，消除体内过剩的自由基，维持机体环境的平衡，而在重度干旱胁迫下SOD也于24 h启动，当干旱程度超过机体耐受限度时SOD活性急剧下降。

POD是植物体内防御活性氧伤害的主要酶类之一[16]。CAT能分解细胞代谢过程中产生的过氧化氢，以避免过氧化氢在生物体内产生毒性作用[17]。APX可以通过清除活性氧而保护细胞免于伤害[18]。实验结果表明，干旱胁迫下金银花体内的CAT活性升高的起始时间较SOD和POD要早，也就是说干旱胁迫下金银花先启动CAT酶来抵御干旱胁迫，当干旱程度超出机体的耐受能力时，CAT活性逐渐下降。

结合各种保护酶的生理生化特性及金银花体内这4种酶活性的动态变化来看，不同程度的干旱胁迫这4种保护酶对干旱胁迫的响应速率不同，金银花首先启动CAT活性，分解植物体内代谢产生的H2O2，其次启动SOD活性，将·O2-歧化为H2O2。POD与SOD酶同时启动将O2催化还原为·O2-，最后启动APX，它可以辅助清除H2O2等活性氧。

[参考文献]

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[9] 高俊凤.植物生理学实验技术[M].西安：世界图书出版公司，2000：194.

[10] 曹慧，王孝威，曹琴，等.水分胁迫下新红星苹果超氧物自由基累积和膜脂过氧化作用[J].果树学报，2001，18（4）：196-199.

[11] 孙伟泽，韩博，胡晓宁，等.不同浓度盐胁迫下苜蓿丙二醛含量变化[J].安徽农业科学，2009，37（5）：1905-1906.

[12] 赵瑞雪，朱慧森，程钰宏，等.植物脯氨酸及其合成酶系研究进展[J].草业科学，2008，25（2）：90-96.

[13] Bell JE，Bell ET.Proteins and enzyme[Z].Prentice-Hall，Inc，1988.

[14] 诺顿.植物蛋白[M].北京：科学出版社，1983.

[15] 孙黎，肖璐，阎平，等.藜科12种盐生植物SOD活性及其同工酶的初步研究[J].石河子大学学报，2004，22（6）：500-503.

[16] 孙存华，李扬，贺鸿雁，等.藜对干旱胁迫的生理生化反应[J].生态学报，2005，25（10）：2556-2560.

[17] 李宏文，史绮，曹阳，等.紫外光对几种水生植物过氧化氢酶（CAT）活性的影响[J].环境科学，1993，4（14）：74-77.

[18] 王超，杨传平，王玉成.白桦抗坏血酸过氧化物酶（APX）基因克隆及表达分析[J].东北林业大学学报，2009，37（3）：79-81.

（收稿日期：2014-05-21 本文编辑：许俊琴）

图1 PEG模拟干旱胁迫对金银花幼苗体内MDA含量的影响

2.2人工模拟干旱胁迫下金银花幼苗体内渗透调节物质的含量变化

不同程度干旱胁迫后24 h植物体内的可溶性糖含量显著提高，胁迫后含量72 h达到峰值，而后缓慢下降，表明金银花幼苗体内的可溶性糖调节机制于干旱胁迫后24 h启动，随着胁迫程度超出机体耐受程度，体内合成可溶性糖的系统遭到破坏，幼苗体内可溶性糖的含量开始缓慢下降（图2A）。不同程度PEG处理后金银花幼苗体内的脯氨酸含量变化趋势相似，均于胁迫后24 h开始升高，于72 h达到顶峰而后下降（图2B）。

图2 PEG模拟干旱胁迫对金银花幼苗体内渗透调节物质含量的影响

2.3 人工模拟干旱胁迫下金银花幼苗体内保护酶活性的变化

不同程度的干旱胁迫条件下，植物体内SOD 活性总体呈现出先增高后降低的趋势。10%PEG和20%PEG干旱胁迫后24 h SOD活性逐渐升高，于处理后72 h达到最大值，分别较对照组提高33.7%和41.2%。30%PEG干旱胁迫后24 h SOD活性上升，胁迫后24～96 h活性比较稳定，96 h后显著下降（图3A）。

10%PEG和30%PEG处理后金银花体内的POD 活性均出现先升高后下降的过程，其活性最大值分别出现在胁迫后48、72 h。20%PEG处理后POD活性处于相对平缓的状态（图3B）。

不同程度干旱胁迫后金银花幼苗体内的CAT活性变化趋势相似，即于干旱胁迫初期显著升高，均在处理后48 h达到峰值，分别高于对照组23.98%（10%PEG）、25.54%（20%PEG）和21.18%（30%PEG），处理后120 h达到最低值（图3C）。

APX活性于干旱胁迫初期无明显变化，干旱胁迫后48h APX活性出现升高趋势，分别写胁迫后96h（10%PEG）、96h（20%PEG）和72h（30%PEG）达到峰值（图3D）。

3 讨论

通常情况下植物细胞内自由基含量处于动态平衡中，当有逆境出现时过剩的自由基会导致膜内脂双分子层中所含的不饱和脂肪酸发生氧化分解，造成细胞膜破坏，增加细胞膜的透性。MDA为脂质过氧化产物，其含量高低可反映膜损伤程度[11]。从金银花幼苗体内的MDA变化情况来看，干旱胁迫初期金银花体内的MDA含量降低，暗示金银花在应对干旱胁迫时的避旱反应，而胁迫后72 h MDA含量逐渐增加，表明随着干旱程度的增加和胁迫的延长，细胞内发生了膜脂的过氧化反应，而且干旱程度越高，细胞膜系统的损伤程度越高。

脯氨酸是植物体内一种重要的小分子渗透物质，脯氨酸含量的多少直接关系到植物抗逆性的强弱[12]。可溶性糖也是植物体内的一种重要的渗透调节剂，水分渗透胁迫下植物体可通过提高可溶性糖的含量来抵御干旱胁迫[13-14]。调节物质变化情况表明金银花幼苗在受到干旱胁迫24 h后，可溶性糖的合成机制开始启动，于胁迫后72 h合成量达到顶峰。上述结果表明金银花幼苗于胁迫后24 h启动体内脯氨酸和可溶性糖的代谢机制来抵御外界干旱胁迫。

SOD对维持·O2-的平衡起重要的作用，是生物保护酶系统的重要成员[15]。从干旱胁迫下活性酶变的化情况来看，低度干旱胁迫和中度干旱胁迫下SOD活性不断升高，消除体内过剩的自由基，维持机体环境的平衡，而在重度干旱胁迫下SOD也于24 h启动，当干旱程度超过机体耐受限度时SOD活性急剧下降。

POD是植物体内防御活性氧伤害的主要酶类之一[16]。CAT能分解细胞代谢过程中产生的过氧化氢，以避免过氧化氢在生物体内产生毒性作用[17]。APX可以通过清除活性氧而保护细胞免于伤害[18]。实验结果表明，干旱胁迫下金银花体内的CAT活性升高的起始时间较SOD和POD要早，也就是说干旱胁迫下金银花先启动CAT酶来抵御干旱胁迫，当干旱程度超出机体的耐受能力时，CAT活性逐渐下降。

结合各种保护酶的生理生化特性及金银花体内这4种酶活性的动态变化来看，不同程度的干旱胁迫这4种保护酶对干旱胁迫的响应速率不同，金银花首先启动CAT活性，分解植物体内代谢产生的H2O2，其次启动SOD活性，将·O2-歧化为H2O2。POD与SOD酶同时启动将O2催化还原为·O2-，最后启动APX，它可以辅助清除H2O2等活性氧。

[参考文献]

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[4] 李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].北京：高等教育出版社，2000：261-263.

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[6] 刘海英，王华华，崔长海，等.可溶性糖含量测定（蒽酮法）实验的改进[J].实验室科学，2013，16（2）：19，20.

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（收稿日期：2014-05-21 本文编辑：许俊琴）