胸腺素β4通过提高Akt磷酸化促进局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质eNOS和CD31表达

庞月珊，罗 勇，谢宸宸，李 满，陈瑞芳，汶海琪

(重庆医科大学附属第一医院神经内科重庆市神经病学重点实验室，重庆400016)

脑缺血后尽快促进血管、神经再生，是治疗缺血性脑血管病减少后遗症的关键。胸腺素β4(thymosinβ4，Tβ4)有多种功能如促进血管再生、神经轴突修复、抑制炎性反应［1-3］等，已经成为脑血管病研究焦点之一。用Tβ4多肽治疗脑卒中和脑外伤大鼠，均发现血管密度在损伤区大脑皮质增加，但其机制还不十分清楚［1-2］。体外研究证实 Tβ4多肽能通过PI3K/Akt/eNOS通路促进内皮祖细胞增殖迁移和抑制内皮组细胞衰老［4］。eNOS是脑缺血后骨髓源性内皮祖细胞强烈的动员剂，能通过SDF-1/CXCR4轴促进内皮祖细胞动员到局部参与血管新生［5］。脑卒中后腹腔注射Tβ4多肽是否也能通过PI3K/Akt通路提高eNOS表达，引起下游SDF-1/CXCR4变化促进血管再生?本实验采用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002，以期阐明Tβ4促进局灶脑缺血/再灌注损伤大鼠大脑皮质血管再生情况及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

Akt和p-Akt多克隆抗体(Cell Signaling公司)，CD31多克隆抗体(Santa Cruz公司)，eNOS多克隆抗体(Immunoway公司)，LY294002(Sigma公司)，总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量扩增试剂盒(Takara公司)，DAB显色试剂盒(北京中杉公司)，磷酸化蛋白提取试剂盒(凯基生物公司)，Tβ4定制多肽(GL Biochem Ltd公司)，β-action单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(碧云天公司)、SP试剂盒及其他相关试剂(北京鼎国公司)。

1.2 模型制备

参照文献［6］介绍经验，制作大鼠右侧大脑中动脉局灶脑缺血/再灌注模型。清洁级雄性SD大鼠120只，体质量230～260 g由重庆医科大学实验动物中心提供［SCXK(渝)2012-0001］。大鼠分为假手术组(S组6只)、模型组(IR组36只)、Tβ4治疗组(IRT组36只)、Tβ4+LY294002组(IRTL组6只)、0.9%氯化钠注射液组(IRN组36只)。IR、IRN和IRT组缺血2 h后分为再灌注3和7 d两个亚组。将冻干粉状的Tβ4多肽用0.9%氯化钠注射液稀释为1 mg/mL。IRT、IRTL组再灌注24 h腹腔注射 Tβ4，6 mg/kg，每 3 天 1 次［1］。IRN 组用同样方法注射等体积0.9%氯化钠注射液。LY294002以25 mmol/L的终浓度在IRTL组大鼠缺血2 h后从侧脑室给药(前囟后0.8 mm、矢状缝旁开1.5 mm，先用锥颅器钻开颅骨，25 μL微量注射器定位，进针3.5 mm)，缓慢给药5 μL，速度为1 μL/min，留针 5 min 后取出。

1.3 神经功能学评分

采用Zea Longa 5分制对所有大鼠行神经功能学评分［7］:无任何症状，0分;提尾悬挂时左前肢屈曲，1分;行走时向左侧转圈，2分;行走时向左侧倾倒，3分;意识丧失，不能自发行走，4分。评分人对动物分组情况未知。

1.4 免疫组化

将切片常规脱蜡至水，3%H2O2室温孵育30 min，1%Trition室温孵育30 min，枸橼酸修复液中微波修复21 min，血清封闭 30 min，加一抗(Tβ4、CD31抗体稀释比均为1∶50)，同时滴加PBS代替一抗作为阴性对照，4℃过夜。37℃复温1 h，加二抗，37℃孵育30 min，加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育30 min，DAB显色，苏木素复染、去蓝、返蓝、脱水、透明和封片。

1.5 Western blot半定量检测

取缺血区大脑皮质100 mg，按凯基磷酸化蛋白提取试剂盒说明书提取磷酸化蛋白。BCA法测蛋白浓度，用4×上样缓冲液将蛋白稀释成相同浓度，100℃沸水中煮10 min，分装后－80℃保存。以40 μg蛋白上样进行SDS-PAGE凝胶电泳(分离胶10%，浓缩胶 5%)，恒压(浓缩胶 60 V，分离胶80 V);再将蛋白转至PVDF膜上(恒流，250 mA);5%牛血清蛋白封闭2 h;加一抗(Akt、p-Akt抗体稀释比为1∶2 000，eNOS 抗体稀释比为1∶200)，4 ℃过夜;37℃复温2 h，TBST洗膜(5 min×3次)，加二抗(稀释比为1∶4 000)，37℃孵育2 h;TBST洗膜(5 min×3次);ECL显像，凝胶成像仪照相，用Quantity One行结果分析。

1.6 荧光定量PCR

取缺血大脑皮质100 mg，按Takara说明书提取总 RNA，取 2 μL 总 RNA 反转录成 20 μL 体系cDNA。根据 Genkbank提供序列用 primer-blast软件设计引物，eNOS上游5'-GCAGAGGAGTCCAGC GAACA-3'，下游 5'-GAAATTGTTCCAGCACCTCTAG C-3'，产物长度115 bp;SDF-1上游5'-TCCGTGGG CTCTGAGTTTTC-3'，下 游 5'-CAGGGCCGTCTGTG ATCATTA-3'，产物长度150 bp;CXCR4上游5'-GG ATGTGAGTTCGAGAGCGT-3，下游 5'-GCGTAGAGG ATGGGGTTCAG-3'，产物长度92 bp。扩增条件为预变性95℃ 30 s，PCR反应95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。

1.7 血管计数

采用Image pro-plus6.0软件分析免疫组化图片并参考文献［8］，先低倍镜(×40)找出大脑皮质缺血半暗带3个血管密度最高的热点区域，再换高倍镜(×200)计数被CD31染成阳性的微血管数目，每个样本用5个200倍视野下的血管数目的平均值表示。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 Tβ4对PI3K/Akt/eNOS信号通路的影响

与IRN组相比，IRT 3 d AKT磷酸化水平显著提高，第7天下降，但还保持在较高水平(P＜0.05)(图1);p-Akt下游蛋白eNOS也在IRT 3 d显著增多(P＜0.01)(图2);与IRT组相比，IRTL 3和7 d p-Akt和eNOS表达显著减少(P＜0.01)(图1，2)。

图1 不同时间点局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质Akt磷酸化水平Fig 1 The phosphorylation level of Akt at different time points in rat cerebral cortex after focal cerebral ischemia/reperfusions，n=6)

图2 不同时间点局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质eNOS蛋白表达Fig 2 The protein expression of eNOS at different time points in rat cerebral cortex after focal cerebral ischemia/reperfusion，n=6)

2.2 Tβ4 对 eNOS、SDF-1、CXCR4 mRNA 的影响

与IRN比较，IRT 3 d eNOS mRNA表达显著升高，第7天降低(P＜0.05);SDF-1、CXCR4和eNOS mRNA有着平行变化的趋势，IRT 3 d增多，7 d降低(P＜0.05)(表1)。

2.3 Tβ4对CD31阳性血管数目影响

与IRN组相比，IRT 3 d CD31阳性微血管密度增加，第7天增加更加明显 (P＜0.05);使用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002后，新生血管的密度显著减少(P＜0.01)(图3)。

表1 各时间点局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质eNOS、SDF-1和CXCR4 mRNA表达Table 1 The mRNA expression of eNOS，SDF-1，CXCR4 at different time point in rat cerebral cortex after focal cerebral ischemia/reperfusion(the values of 2 －△△CT)(± s，n=6)

表1 各时间点局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质eNOS、SDF-1和CXCR4 mRNA表达Table 1 The mRNA expression of eNOS，SDF-1，CXCR4 at different time point in rat cerebral cortex after focal cerebral ischemia/reperfusion(the values of 2 －△△CT)(± s，n=6)

*P＜0.05 compared with IRN group 3 days;#P＜0.05 compared with IRN group 7 days;△P ＜0.01 compared with IRTL group．

group time point eNOS SDF-1 CXCR4 IRN 3 days 2.2±0.2△ 1.1±0.2△ 0.9±0.2△7 days 1.6±0.1 0.6±0.1 0.6±0.1 IRT 3 days 3.1±0.2＊△ 1.4±0.2＊△ 1.4±0.2＊△7 days 1.9±0.1# 1.0±0.2# 0.9±0.2#IRTL － 0.4±0.1 0.3±0.1 0.2±0.1

2.4 Tβ4治疗后大脑皮质Tβ4表达情况

与IRN组比较，IRT 3 d大脑皮质缺血半暗带Tβ4蛋白表达最多(P＜0.01);在梗死区，Tβ4在胶质细胞表达多见;缺血半暗带，Tβ4表达在神经元表达多见(图4)。

2.5 神经功能学评分

与IRN组相比，IRT 3 d神经功能改善并不显著，但第7天神经功能改善显著(P＜0.05);与IRTL组比较，IRT组神经功能恢复较好(P＜0.05)(表 2)。

3 讨论

“神经血管单元”由神经元、血管、胶质细胞组成，脑缺血后各成分相继损害。近年对“神经血管单元”的整体研究逐渐受到重视。Tβ4有促进血管再生、神经轴突修复、抑制炎性反应［1-3］等功能，是治疗局灶脑缺血/再灌注“神经血管单元”损伤的最佳候选者。

图3 各时间点局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质CD31阳性新生血管密度变化情况Fig 3 The changes of CD31 positive new vessels at different time points in rat cerebral cortex after focal cerebral ischemia/reperfusion(×200，n=6)

图4 局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质缺血半暗带Tβ4表达情况Fig 4 The expression of Tβ4 in rat cerebral cortex ischemic penumbra after focal cerebral ischemia/reperfusion(×400，n=6)

表2 神经功能评分Table 2 The scores of neurobehavioral function± s，n=18)

表2 神经功能评分Table 2 The scores of neurobehavioral function± s，n=18)

*P＜0.05 compared with IRN group 7 day;#P＜0.05 compared with IRTL group．

focal cerebral ischemia/reperfusion group 3 days 7 days IRN 2.8±0.4 2.2±0.7 IRT 2.7±0.5# 1.0±0.2*#IRTL 3.3±0.5 2.6±0.5

本研究发现Tβ4治疗第2天大脑皮质缺血半暗带Tβ4蛋白表达比IRN组显著增多，这说明腹腔注射Tβ4后大脑皮质有预期Tβ4蛋白表达的变化，而文献［1-3］没有检测。IRN 3 d p-Akt和eNOS表达升高，第7天下降，与文献［9，12］相符。体外研究已经证实Tβ4能通过提高p-Akt表达保护急性和慢性缺血的内皮祖细胞［10］，激活下游eNOS减缓内皮祖细胞衰老［11］，并促进大鼠缺血心肌血管再生［12］。而本实验中IRT 3d Akt磷酸化水平显著升高，第7天下降，使用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002后，p-Akt和eNOS表达显著减少，故推测Tβ4可能通过提高大鼠缺血大脑皮质p-Akt表达，促进下游eNOS表达增加。研究认为局灶脑缺血/再灌注损伤后大脑皮质eNOS、SDF-1升高能促进骨髓源性内皮祖细胞归巢和缺血半暗带血管再生［13-14］。本实验IRT组SDF-1、CXCR4 mRNA在缺血大脑皮质表达比IRN组3和7 d显著升高，与eNOS蛋白和基因变化有相同的趋势。与IRN组比较，IRT组CD31阳性微血管密度显著增多，神经功能改善显著与参考文献［1］相符，推测Tβ4可能通过提高Akt磷酸化，促进血管再生和神经功能恢复。

Tβ4作为一种新药已进入2期临床试验，但其作用机制尚不十分清楚。本实验发现大鼠局灶脑缺血/再灌注损伤后，腹腔注射Tβ4多肽可能通过提高Akt磷酸化水平促进eNOS表达，并引起下游相应基因蛋白变化，促进大脑皮质缺血半暗带血管再生和神经功能恢复。但此实验并没有对eNOS进行直接干扰，因此将eNOS基因沉默后对Tβ4下游信号通路的研究成为未来的研究方向。

［1］Morris DC，Chopp M，Zhang L，et al．Thymosin beta4 improves functional neurological outcome in a rat model of embolic stroke［J］．Neuroscience，2010，169:674-682．

［2］ Xiong Y，Zhang Y，Mahmood A，et al．Neuroprotective and neurorestorative effects of thymosin beta4 treatment initiated 6 hours after traumatic brain injury in rats［J］．J Neurosurg，2012，116:1081-1092．

［3］Sosne G，Qiu P，Christopherson PL，et al．Thymosin beta 4 suppression of corneal NFkappaB:a potential anti-inflammatory pathway［J］．Exp Eye Res，2007，84:663-669．

［4］邱福宇．Tβ4对外周血内皮祖细胞功能的影响及机制的探讨［D］．浙江:浙江大学医学院，2009，1-87．

［5］Isabelle P，David J，Shahin R．The SDF-1-CXCR4 signaling pathway:a molecular hub modulating neo-angiogenesis［J］．TRENDS in Immunology，2007，28:299-307．

［6］罗勇，董为伟．Wistar大鼠插线法局灶性脑缺血/再灌注模型的实验研究［J］．重庆医科大学学报，2002，27:1-4．

［7］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］．Stroke，1989，20:84-91．

［8］Weidner N．Intratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer［J］．Am J Pathol，1995，147:9-19．

［9］张珊珊，罗勇，武磊．PI3K/AKT通路在电针促进局灶脑缺血再灌注大鼠脑内血管再生中的作用［J］．第三军医大学学报，2010，32:2488-2491．

［10］ Hinkel R，Bock-Marquette I，Hatzopoulos AK，et al．Thymosin beta4:a key factor for protecttive effects of eEPCs in acute and chronic ischemia［J］．Ann NY Acad Sci，2010，1194:105-111．

［11］Li J，Yu L，Zhao Y，et al．Thymosin β4 reduces senescence of endothelial progenitor cells via the PI3K/Akt/eNOS signal transduction pathway［J］．Mol Med Rep，2013，7:598-602．

［12］乔海兵，丁大有，聂李亚，等．胸腺素β4对急性心肌梗死大鼠心肌磷酸化蛋白激酶表达及纤维化的影响［J］．解剖学杂志，2011，34:609-611．

［13］卢桃利，罗勇，孙宏毅，等．电针对局灶脑缺血再灌注大鼠大脑皮质eNOS mRNA及蛋白、MMP-9蛋白表达的影响［J］．基础医学与临床，2012，32:158-163．

［14］赵旺，罗勇．电针对局灶脑缺血再灌注大鼠大脑皮质基质细胞衍生因子-1α表达的影响极其促进脑内血管再生的作用［J］．中华物理医学与康复杂志，2010，32:409-413．