水稻光敏色素A基因克隆及其在光形态建成中的作用

陈 由, 王亚琴

(华南师范大学生命科学学院, 广东省植物发育生物工程重点实验室,广州 510631)

对高等植物而言, 光不仅是光合作用的能量来源, 同时也是一种重要的环境信号. 高等植物利用光敏色素(phytochromes, phy)、隐花色素(cryptochromes)和向光素(phototropins)等光受体时刻监测着其生长环境中光质、光强、光周期等条件的变化，不断调节自己的生长发育，以最大限度适应周围环境[1-4]. 其中, 光敏色素主要感受红光(red light, R)和远红光(far-red light, FR)，参与调节植物生命循环中多个重要发育过程[2,5]. 在各种光敏色素中，phyA主要负责对远红光的感知，调节高辐照度反应(High irradiance response,HIR)和介导黄化苗的极低辐照度反应(very low fluence response, VLFR). PhyA是一种植物自身合成的色素蛋白质，由生色团(chromophore)和脱辅基蛋白(apoprotein)2部分组成，在细胞质中合成后，必须从细胞质转移到细胞核才能与核内的其他蛋白质相互作用[3-4,6-7], 从而或正或负影响植物光形态建成的发生, 如种子萌发、幼苗去黄化、避阴反应、光周期开花和育性等[2,8-11].

水稻(OryzasativaL.)作为世界上最重要的粮食作物之一，是单子叶植物基因组学遗传和功能研究的模式植物.水稻光敏色素基因家族包括3个成员：PHYA,PHYB和PHYC[12-13].研究发现水稻phyA, phyB和phyC在幼苗光形态建成中具有重要作用，3种光敏色素介导的光信号均能够抑制胚芽鞘的延伸，诱导光调控基因(LHCB和RBCS)的表达[8,14].水稻PHYA在光形态建成中具体的作用是什么呢？它是否能够影响水稻的其它农艺性状？在本研究中，作者分析了OsPHYA在水稻中的表达分布及其在水稻光形态建成中的作用，包括极低辐照度和高辐照度下水稻胚芽鞘伸长、极低辐照度下的萌发率、去黄化过程中叶绿素的合成以及水稻成熟期的农艺性状等.结果表明，OsphyA在黑暗中积累，表达不具有组织特异性，OsphyA在水稻幼苗光形态建成中起主导作用，但对水稻成熟期农艺性状的影响不明显.本研究克隆了水稻OsPHYA基因.

1 材料与方法

1.1 植物材料

水稻光敏色素A突变体phyA(NC2788和NC2793)及其对应的野生型(WT)均为日本晴品种(OryzasativaL.), 突变体的遗传背景是phyA4[15].

1.2 水稻的种植

将种子剥去颖壳, 先用体积分数为70%乙醇表面消毒1 min, 无菌水清洗3次, 再用质量分数为2%的次氯酸钠溶液杀菌消毒15 min, 期间时常振荡, 最后用无菌水冲洗5次, 转移到无菌滤纸上吸干表面的水分, 均匀接种在MS固体培养基上, 用封口膜封好后, 将其置于光强100 μmol/(m2·s), 光周期16 h/8 h(光/暗), 温度28 ℃, 相对湿度80%的培养室中培养.

1.3 种子萌发

水稻野生型和OsphyA突变体种子去壳、表面消毒后, 播种于MS培养基上, 4℃放置过夜. 次日将其移至黑暗或者光照(28℃ 远红光)下培养3 d, 然后分析种子的萌发情况, 胚根和胚芽均长于1 mm 即视为萌发.

1.4 OsPHYA基因的表达分析

取培养10 d的水稻幼苗根、茎和叶. 提取植物总RNA，并反转录得到cDNA的第一链，以此链为模板，用Actin作内参，通过半定量RT-PCR分析基因表达情况.

1.5 胚芽鞘测量

水稻野生型和OsphyA突变体种子去壳、表面消毒后，播种于MS培养基, 4℃放置过夜，再将其转移到黑暗、连续红光、脉冲红光(光照强度为28 μmol/(m2·s)，脉冲时间3 min)、连续远红光、脉冲远红光(光照强度为2 μmol/(m2·s)，脉冲时间3 min)下培养10 d，分别测量水稻幼苗胚芽鞘长度. 每个处理至少测量15棵幼苗，实验数据使用Excel 2003进行分析，每个实验重复3次.

1.6 叶绿素含量测定

水稻野生型和OsphyA突变体种子各10粒，经消毒后接种到MS培养基上，黑暗处理4 d，得到白化苗.白化苗经过红光的脉冲处理3 min，黑暗处理4 h，之后进行白光照射，时间做梯度处理：0、2、4、6 h，然后测叶绿素含量.

1.7 农艺性状的考查

成熟期从小区水稻田中随机选取10株水稻植株，考查分蘖数、株高、穗长、每株穗数、每穗总粒数、结实率、千粒质量等农艺性状,用Excel进行数据的统计和分析.

2 结果与分析

2.1 OsPHYA基因的克隆及突变体鉴定

通过RT-PCR方法克隆了OsPHYA基因(图1A)，其完整的ORF包括3 387个核苷酸，编码1 129个氨基酸残基，蛋白约125×103. 为进一步研究水稻OsphyA蛋白的功能，购买了Tos17插入突变体，利用“三引物法”对突变体进行纯合体鉴定；通过水稻突变体库得到Tos17上的边界引物LB，并且在Tos17插入位点的上下游100 bp处设计左端(LP)和右端(RP)引物，利用这3个引物做三引物PCR鉴定实验. 野生型植株目的基因的2条染色体上均未发生Tos17插入，其PCR产物相对分子量即为LP到RP的大小；突变体纯合植株目的基因的2条染色体上均发生Tos17插入，由于Tos17插入造成片段过长，普通PCR难于扩增，所以只能得到1种以LB与LP (或RP)为引物进行扩增的产物；鉴定结果表明(图1B)，突变体NC2788和NC2793均为纯合体植株.在此基础上，对插入纯合的突变体提取RNA进行RT-PCR，在RNA水平上鉴定Tos17插入是否抑制了OsPHYA基因的表达.结果发现(图1 C)，NC2788株系没有检测到OsPHYA基因的表达，而NC2793株系检测非常微量的表达.说明NC2788为基因完全缺失突变体，而NC2793突变体株系则为基因部分缺失突变体.

(1)PCR产物鉴定，M为分子标准；(B)突变体株系纯合体的鉴定，1为LP+RP的扩增结果，2为LB+LP或RP的扩增结果；(C)RT-PCR鉴定.

图1 水稻光敏色素A基因的克隆和鉴定

Figure 1 Cloning and mutant identification of rice phytochrome A

2.2 光、暗诱导下水稻光敏色素A基因的表达

研究正常生长状态下基因的时空表达模式对预测基因的功能有着重要的作用.光敏色素A基因是参与光形态建成的主要光敏色素，受环境、发育以及特定组织的信号调节等影响.通过RT-PCR检测了水稻植株在光暗条件下不同组织器官中OsPHYA的表达情况, 结果表明，在光照和黑暗条件下，OsPHYA在根、茎、叶中都有表达(图2)，且在黑暗条件下的表达水平明显高于光照条件.

图2 光照、黑暗条件下水稻植株中OsPHYA的表达检测

2.3 VLFR反应条件下水稻种子的萌发

在拟南芥中，phyA调控VLFR反应，在持续远红光照射下促进种子萌发.为了验证水稻中phyA是否具有此功能，选取能够引起VLFR反应的3个梯度的FR辐照度(0.02、0.16、1.5 μmol/(m2·s))进行种子萌发实验.

3个FR(远红光)辐照梯度中，0.16 μmol/(m2·s)辐照度下野生型植株的萌发率和突变体植株相近，而在0.02、1.5 μmol/(m2·s)辐照度下，野生型植株的萌发率都要高于突变体植株；并且在1.5 μmol/(m2·s)的辐照度下，差异达到显著水平.说明水稻phyA在FR介导的VLFR反应中起作用，诱导水稻种子萌发.而突变体植株中由于缺少了水稻phyA，萌发率普遍降低(图3).

*号表示差异水平显著

Figure 3 Seed germination rate of WT andOsphyAmutants under VLFR

2.4 VLFR和HIR反应条件下水稻胚芽鞘的伸长

在单子叶植物中，胚芽鞘长度是反映不同光条件下光形态建成强弱的表型之一.作者验证了持续红光、远红光或脉冲红光、远红光对野生型和突变体胚芽鞘伸长的影响.

不同光质条件下野生型和phyA突变体的胚芽鞘长度存在差异. 从统计图(图4C)中表明，在黑暗条件下，野生型和突变体都展示了典型的胚芽鞘伸长的表型.在持续的红光条件下，各个基因型的胚芽鞘长度都受到强烈抑制，长度基本一样.而在持续的远红光条件下，野生型的胚芽鞘长度明显短于2个突变体株系.作者同时测定了VLFR条件下胚芽鞘的伸长，在PR条件下，各个基因型的胚芽鞘长度都受到抑制.而在PFR条件下，野生型的胚芽鞘长度明显短于2个突变体株系.结果说明，水稻phyA感受远红光信号，抑制水稻胚芽鞘的伸长.同时也说明水稻phyA不调节红光反应.

D：dark 黑暗；pFR：pulse of far-red light 远红光脉冲；cFR：continuous far-red light 持续远红光；pR：pulse of red light 红光脉冲；cR：continuous red light 持续红光；bar=1 cm

图4 不同光质条件下野生型和OsphyA突变体胚芽鞘的伸长

Figure 4 Coleoptile elongation of WT andOsphyAmutants under different light conditions

2.5 水稻光敏色素A在白化苗转绿实验中的作用

叶绿素含量的积累是去黄化反应的表现之一，黑暗生长的水稻幼苗表现出暗形态建成特征，如胚芽鞘长、缺少叶绿素和光调控基因表达受阻等；而光下生长的水稻幼苗表现出胚芽鞘受抑制、叶绿素合成和光调控基因表达被激活等光形态建成特征[16]. 为了确切了解OsPHYA基因是否参与水稻白化苗的去黄化过程, 测定了水稻白化苗转绿过程中叶绿素的含量变化(图5).

随着光照时间的增加，各基因型植株叶绿体含量呈上升趋势(图5)，而野生型植株的叶绿素含量增加幅度较快，在白光处理6 h与突变体株系达到了显著差异.表明光敏色素A参与了水稻白化苗转绿的过程，并在叶绿素合成的过程中起作用.水稻光敏色素A突变体因缺少PHYA基因，其叶绿素合成受到了影响.

2.6 水稻光敏色素A对水稻农艺性状的影响

图5 野生型和OsphyA突变体在白化苗转绿过程中叶绿素质量浓度的变化

Figure 5 Chlorophyll content change of WT andOsphyAmutants during de-etiolation

光敏色素基因是一类调控重要农艺性状的基因，有利于改良作物的株高、产量等有利性状.研究表明，转光敏色素基因的番茄、烟草和马铃薯均表现为植株降低、光合效率增强和产量提高[17].因此，作者从分蘖数、株高、穗长、每株穗数、每穗总粒数、结实率、千粒质量等方面比较了水稻phyA突变体和野生型的差别，了解水稻phyA在农艺性状中的作用.

仅仅突变体株系2788在每株穗数这个农艺指标上与野生型存在显著差异(表1)，而在分蘖数、株高、穗长、每穗总粒数、结实率、千粒质量等几个农艺性状方面，2个突变体株系和野生型差异不明显.说明水稻光敏色素A在农艺性状方面所起作用不大，控制水稻产量等农艺性状指标是综合因素的影响.

表1 水稻野生型与OsphyA突变体农艺性状的比较Table1 Comparison of agronomic traits in WT and OsphyA mutants

注： 同列中后附不同字母表示0.05 水平差异显著性.

3 讨论

光敏色素A为光不稳定型，其基因的转录受不同光调控而表现为不同的模式[18]. 在黑暗中，通过转录和转录后水平的组合调节，表达水平能够达到光条件下积累水平的100倍以上[19].研究发现黑暗条件下光敏色素A的表达水平明显高于白光处理，与上述研究结果相吻合. 同时也验证了光敏色素A在细胞质中合成，见光后进入细胞核的过程其实是蛋白的一个降解过程[20].

种子萌发与否取决于种子内的Pfr含量和Pfr/(Pr+Pfr)比值.Pfr/(Pr+Pfr)比值称为光稳定平衡值[21].一些植物种子需要特定的光稳定平衡值才能萌发[21].究竟二者(Pfr绝对含量和Pfr/(Pr+Pfr)相对比值)中哪个是起关键的诱导作用？目前尚无统一的结论[22].总体上, 光敏色素促进种子萌发可以通过VLFR和LFR等2个反应实现.VLFR反应受phyA调控, LFR则受到phyA以外光敏色素(phyB、phyC、phyD或phyE)的调控[23].作者发现，在远红光1.5 μmol/(m2·s)条件下，缺少OsPHYA基因的突变体种子萌发率显著低于野生型，说明OsphyA能够在FR介导的VLFR反应中促进水稻种子萌发. 然而OsphyA只是促进水稻种子萌发的条件之一，要进一步认识水稻种子内光敏色素调控种子萌发的生理反应模式，还应考虑到许多其他相关的影响因素(如OsphyB、植物激素等).

水稻胚芽鞘生长是一个重要的光形态建成特征，这个特征受到OsphyA、OsphyB和OsphyC的调节.在本实验中，野生型和OsphyA突变体植株在持续远红光或者远红光脉冲条件下都表现出一定程度的胚芽鞘抑制现象，说明OsphyA在远红光条件下，参与了抑制胚芽鞘伸长的反应.黑暗条件下，由于光形态的缺失，不管是野生型还是突变体，都表现出黄化苗的特征.当红光持续照射时，各个基因型的胚芽鞘长度都受到强烈抑制，长度基本一样，说明OsphyA不调节红光反应. 虽然远红光抑制单子叶胚芽鞘的伸长和抑制双子叶下胚轴的伸长都是抑制细胞的伸长所产生，但单子叶植物拟南芥和双子叶植物水稻之间还是存在着区别.前者是VLFR起主要介导作用，而后者主要是HIR起作用[15].

农艺性状是衡量水稻各方面产量的综合指标，Kong等[24]发现在水稻中，利用植物在光照条件下特异表达的RBCS基因的启动子，过量表达拟南芥的光敏色素A基因，转基因植株会出现植株变矮、谷粒增大、叶绿素含量增高等性状. Iwamoto等[25]研究表明，光敏色素A在水稻幼苗光形态建成方面起重大的作用，但对于成熟水稻的影响则相对较弱. 顾建伟等[5]通过比较水稻野生型和所有光敏色素突变体的生长发育特征，发现3个光敏色素在水稻生长发育中具有重叠或特异的调控作用. 在本实验中检测了水稻的7个典型的农艺性状. 结果显示，自然光照条件下水稻phyA突变体和野生型的农艺性状没有明显的差异，说明水稻光敏色素A的缺失不会对水稻的产量造成影响. 水稻农艺性状是复杂的多层次基因网络调控的结果，同时环境胁迫也起着很重要的作用.

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