半夏愈伤组织诱导与分化最适培养基筛选

林秋月等

摘要：以半夏[Pinellia ternata （Thunb.）Breit.]叶片为试验材料，研究不同培养基配方对半夏叶片的诱导脱分化、愈伤组织增殖及分化的影响。结果表明，适合半夏叶片诱导脱分化的培养基为MS+0.8 mg/L 6-BA+1.8 mg/L NAA+0.1 mg/L 2，4-D；适合愈伤组织增殖的培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D；适合分化生长的培养基为MS+0.8 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA+3.0 mg/L 2，4-D。

关键词：半夏[Pinellia ternata（Thunb.）Breit.]；组织培养；激素；愈伤组织

中图分类号：Q943.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）13-3183-04

Screening of Optimal Medium for Callus Inducing and Redifferentiation of

Pinellia ternata （Thunb.）Breit.

LIN Qiu-yue，ZENG Wan-yong，LI Tian-pei，LI Rui，CHEN Ping，LI Jin-hua

（School of Biology and Pharmaceutical Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023， China）

Abstract： Leaves of Pinellia ternata（Thunb.）Breit. were used to investigate the effects of several mediums on the induced dedifferentiation ratio， callus proliferation ratio and redifferentiation ratio of leaves of Pinellia ternata （Thunb. ）Breit.. The results showed that the optimal medium for leaves dedifferentiation， callus proliferration and redifferentiation were MS+0.8 mg/L 6-BA+1.8 mg/L NAA+0.1 mg/L 2，4-D，MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D and MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3.0 mg/L 2，4-D，respectively.

Key words： Pinellia ternata （Thunb.）Breit.； tissue culture； hormone； callus

半夏[Pinellia ternata （Thunb.）Breit.]别名旱半夏、三叶半夏、半月莲， 为天南星科半夏属多年生草本植物，以块茎入药，能燥湿化痰、降逆止咳，生用消疖肿，主治咳嗽痰多、恶心呕吐等[1]。半夏含半夏生物碱、半夏蛋白、β-谷甾醇、刺激性成分草酸钙、多种氨基酸等，还含有挥发油、游离有机酸、3， 4-二羟基苯甲醛、淀粉、胆碱和葡萄糖苷等多种成分。半夏生物碱有镇痛、抗血栓形成等作用；半夏蛋白、β-谷甾醇有抗肿瘤作用。因此，备受国内外的关注，需求量较大[2]。由于连年采挖，半夏野生资源日趋枯竭，人工栽培种源缺乏、繁殖系数低，且病虫害感染严重，致使药材质量不稳定。而半夏组培苗具有生长速度快、繁殖系数高、不带病毒等特点， 所以利用组织培养再生苗或者用于提取有效成分已成为发展的趋势。

有学者对半夏愈伤组织诱导和分化进行了研究[3-6]。在前期对其他中药材组培研究的基础上[7，8]，本研究选用半夏叶片为外植体，比较了不同培养基成分对愈伤组织培养的影响，探索愈伤组织诱导、继代和分化等时期的最适激素配比，以获得半夏细胞工程研究中各环节的最佳条件，旨在为实现半夏种苗和有效成分的工厂化生产以及开展人工种子研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料采自恩施州野三关野生半夏种球。

1.2 方法

1.2.1 半夏外植体的获得 将野外采集的半夏种球种植在花盆中，待叶片出土展开后取样，经灭菌作为诱导愈伤组织的外植体。

1.2.2 培养基配制 基本培养基为MS培养基，加入蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L，肌醇0.1 g/L，酸水解酪蛋白（CH）0.3 g/L，pH 5.8，附加不同激素配比（表1）。121 ℃灭菌20 min，备用。

1.2.3 半夏叶片的诱导脱分化 以MS为基本培养基，按表1分别添加不同浓度的6-BA、NAA、2，4-D，每瓶分装培养基约40 mL。将健康无菌的叶片接种于培养基中，每瓶接种5片叶，每组接种10瓶。接种好的样品置于培养室中暗培养，培养温度为25 ℃。每5 d统计叶片诱导率（叶片脱分化面积占整片接种材料的比例），采用t检验分析不同激素配比对半夏脱分化的差异显著性水平。

1.2.4 半夏愈伤组织的增殖 将生长状态相同的愈伤组织转接到增殖培养基中（B0-B7），在黑暗条件下25 ℃培养，每5 d观察并统计愈伤组织的增殖情况（愈伤组织的直径），分析不同激素配比下对愈伤组织增殖的影响。

1.2.5 半夏愈伤组织的分化 将生长状态相同的增殖愈伤组织转接到分化培养基（B0-B7）中。在黑暗中继续培养5 d后光照下培养，光照为16 h/d，光照度为2 000～2 500 lx。每5 d观察并统计愈伤组织的出芽数（以叶柄高于5 mm计为1苗），并分析不同激素配比对诱导分化的影响。

2 结果与分析

2.1 半夏叶片的诱导脱分化

从图1可以看出，在MS培养基上添加不同配比的激素，除对照组外，均能诱导半夏叶片的脱分化，但愈伤组织的诱导率差异较大。接种后5 d观察，已经有愈伤组织产生，愈伤组织产生速度最快是B4培养基，在15 d时已经超过80%。在黑暗条件下诱导的愈伤组织颜色嫩黄，质量均较好（图2）。经过显著性水平分析，15 d时B4培养基的诱导率与对照达到显著差异水平，因此，B4培养基最适合半夏叶片的诱导脱分化。

2.2 半夏愈伤组织的增殖

从图3可以看出，在MS培养基上添加不同配比的激素，对半夏愈伤组织的增殖存在明显影响。经过20 d的观察统计，B2和B4培养基上半夏愈伤组织的增殖速度较快，B3有分化情况出现（图4）。经过显著性分析，20 d时B2培养基上半夏愈伤组织直径与对照相比差异较大，但处理之间未达到显著水平。因此，B2培养基较适合半夏愈伤组织的增殖培养。

2.3 半夏愈伤组织的分化

在MS培养基上添加不同配比的激素，对半夏愈伤组织的分化影响较大，其中，B1、B2、B3、B4培养基接种5～15 d，半夏愈伤组织均有出芽，B3培养基接种15 d后愈伤组织出芽数最多，B5、B6、B7培养基上的分化芽很少（图5）。经过显著性差异分析，15 d 时B3培养基上的出芽数与对照相比差异达到显著水平，因此，B3培养基最适合半夏愈伤组织的分化。

3 结论与讨论

半夏是我国重要的大宗药材，研究发现除了传统的药用功效外，其生物碱还具有抑制多种肿瘤细胞增殖的功能，其多糖具有清除羟自由基的功能[9]，其蛋白质具有抗肿瘤、抗生育、抗蚜虫的功能。目前，半夏的市场需求量越来越大，而生产上由于种苗供应不足，供需矛盾越来越突出，导致市场价格持续攀升。近年来，对半夏种苗快速繁殖技术的研究越来越多，人工种子研究也有报道[10]。半夏组织培养研究不仅有助于种苗生产，还有助于利用细胞工程工厂化生产药用成分，解决在半夏田间生长慢的问题。

本试验结果表明，中等浓度的激素水平有利半夏叶片愈伤组织诱导，较高浓度的激素反而抑制其叶片脱分化。2，4-D对半夏愈伤组织增殖有促进作用。叶片前期脱分化水平影响到后期愈伤组织的增殖，相对而言，脱分化水平越高，增殖效果越好。但是不同激素水平对愈伤组织增殖的效率存在差异。在暗培养中，同时观察到B1、B3培养基上最先出现根的生长，B3生根较多。

综合分析表明，适合半夏一次性成苗的培养配方为MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3.0 mg/L 2，4-D。此配方得到的半夏愈伤组织丛芽较多，长势较壮且长有根，且均能分化成苗。

参考文献：

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志.第13卷第2册[M]. 北京：科学出版社，1979.

[2] 毛子成，彭正松.半夏研究进展[J].江西科学，2002，20（1）：42-46.

[3] 程霞英，杨宗岐.半夏愈伤组织诱导优化研究[J].天津农业科学，2013，19（9）：4-6.

[4] 彭向前，张文会.半夏的分生组织培养与快速繁殖技术研究[J].井冈山大学学报（自然科学版），2011，32（2）：46-49.

[5] 杨玉珍，王西雨，胡如善，等.半夏的组织培养与快繁试验[J].山东农业科学，2010（1）：10-11.

[6] 马宗新.半夏的组织培养研究[J].安徽农学通报，2009，15（8）：40，232.

[7] LI W， XIE Y M， LUO C P， et al. Study on rapid propagation medium of atractylodes lances by orthogonal design[J].Agricultural Science & Technology，2012，13（1）：49-52.

[8] 曾万勇，李金华，王 智，等.铁皮石斛无菌萌发及小苗快繁培养条件研究[J].武汉工业学院学报，2012，31（3）：10-12，47.

[9] 郭辉娟，魏定国.半夏多糖提取工艺优化及其清除自由基能力研究[J].安徽农业科学，2010，38（34）：19341-19342，19345.

[10] 张苏锋.半夏人工种子的研究[J].信阳师范学院学报（自然科学版），1998，11（3）：281-282.

2 结果与分析

2.1 半夏叶片的诱导脱分化

从图1可以看出，在MS培养基上添加不同配比的激素，除对照组外，均能诱导半夏叶片的脱分化，但愈伤组织的诱导率差异较大。接种后5 d观察，已经有愈伤组织产生，愈伤组织产生速度最快是B4培养基，在15 d时已经超过80%。在黑暗条件下诱导的愈伤组织颜色嫩黄，质量均较好（图2）。经过显著性水平分析，15 d时B4培养基的诱导率与对照达到显著差异水平，因此，B4培养基最适合半夏叶片的诱导脱分化。

2.2 半夏愈伤组织的增殖

从图3可以看出，在MS培养基上添加不同配比的激素，对半夏愈伤组织的增殖存在明显影响。经过20 d的观察统计，B2和B4培养基上半夏愈伤组织的增殖速度较快，B3有分化情况出现（图4）。经过显著性分析，20 d时B2培养基上半夏愈伤组织直径与对照相比差异较大，但处理之间未达到显著水平。因此，B2培养基较适合半夏愈伤组织的增殖培养。

2.3 半夏愈伤组织的分化

在MS培养基上添加不同配比的激素，对半夏愈伤组织的分化影响较大，其中，B1、B2、B3、B4培养基接种5～15 d，半夏愈伤组织均有出芽，B3培养基接种15 d后愈伤组织出芽数最多，B5、B6、B7培养基上的分化芽很少（图5）。经过显著性差异分析，15 d 时B3培养基上的出芽数与对照相比差异达到显著水平，因此，B3培养基最适合半夏愈伤组织的分化。

3 结论与讨论

半夏是我国重要的大宗药材，研究发现除了传统的药用功效外，其生物碱还具有抑制多种肿瘤细胞增殖的功能，其多糖具有清除羟自由基的功能[9]，其蛋白质具有抗肿瘤、抗生育、抗蚜虫的功能。目前，半夏的市场需求量越来越大，而生产上由于种苗供应不足，供需矛盾越来越突出，导致市场价格持续攀升。近年来，对半夏种苗快速繁殖技术的研究越来越多，人工种子研究也有报道[10]。半夏组织培养研究不仅有助于种苗生产，还有助于利用细胞工程工厂化生产药用成分，解决在半夏田间生长慢的问题。

本试验结果表明，中等浓度的激素水平有利半夏叶片愈伤组织诱导，较高浓度的激素反而抑制其叶片脱分化。2，4-D对半夏愈伤组织增殖有促进作用。叶片前期脱分化水平影响到后期愈伤组织的增殖，相对而言，脱分化水平越高，增殖效果越好。但是不同激素水平对愈伤组织增殖的效率存在差异。在暗培养中，同时观察到B1、B3培养基上最先出现根的生长，B3生根较多。

综合分析表明，适合半夏一次性成苗的培养配方为MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3.0 mg/L 2，4-D。此配方得到的半夏愈伤组织丛芽较多，长势较壮且长有根，且均能分化成苗。

参考文献：

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志.第13卷第2册[M]. 北京：科学出版社，1979.

[2] 毛子成，彭正松.半夏研究进展[J].江西科学，2002，20（1）：42-46.

[3] 程霞英，杨宗岐.半夏愈伤组织诱导优化研究[J].天津农业科学，2013，19（9）：4-6.

[4] 彭向前，张文会.半夏的分生组织培养与快速繁殖技术研究[J].井冈山大学学报（自然科学版），2011，32（2）：46-49.

[5] 杨玉珍，王西雨，胡如善，等.半夏的组织培养与快繁试验[J].山东农业科学，2010（1）：10-11.

[6] 马宗新.半夏的组织培养研究[J].安徽农学通报，2009，15（8）：40，232.

[7] LI W， XIE Y M， LUO C P， et al. Study on rapid propagation medium of atractylodes lances by orthogonal design[J].Agricultural Science & Technology，2012，13（1）：49-52.

[8] 曾万勇，李金华，王 智，等.铁皮石斛无菌萌发及小苗快繁培养条件研究[J].武汉工业学院学报，2012，31（3）：10-12，47.

[9] 郭辉娟，魏定国.半夏多糖提取工艺优化及其清除自由基能力研究[J].安徽农业科学，2010，38（34）：19341-19342，19345.

[10] 张苏锋.半夏人工种子的研究[J].信阳师范学院学报（自然科学版），1998，11（3）：281-282.

2 结果与分析

2.1 半夏叶片的诱导脱分化

从图1可以看出，在MS培养基上添加不同配比的激素，除对照组外，均能诱导半夏叶片的脱分化，但愈伤组织的诱导率差异较大。接种后5 d观察，已经有愈伤组织产生，愈伤组织产生速度最快是B4培养基，在15 d时已经超过80%。在黑暗条件下诱导的愈伤组织颜色嫩黄，质量均较好（图2）。经过显著性水平分析，15 d时B4培养基的诱导率与对照达到显著差异水平，因此，B4培养基最适合半夏叶片的诱导脱分化。

2.2 半夏愈伤组织的增殖

从图3可以看出，在MS培养基上添加不同配比的激素，对半夏愈伤组织的增殖存在明显影响。经过20 d的观察统计，B2和B4培养基上半夏愈伤组织的增殖速度较快，B3有分化情况出现（图4）。经过显著性分析，20 d时B2培养基上半夏愈伤组织直径与对照相比差异较大，但处理之间未达到显著水平。因此，B2培养基较适合半夏愈伤组织的增殖培养。

2.3 半夏愈伤组织的分化

在MS培养基上添加不同配比的激素，对半夏愈伤组织的分化影响较大，其中，B1、B2、B3、B4培养基接种5～15 d，半夏愈伤组织均有出芽，B3培养基接种15 d后愈伤组织出芽数最多，B5、B6、B7培养基上的分化芽很少（图5）。经过显著性差异分析，15 d 时B3培养基上的出芽数与对照相比差异达到显著水平，因此，B3培养基最适合半夏愈伤组织的分化。

3 结论与讨论

半夏是我国重要的大宗药材，研究发现除了传统的药用功效外，其生物碱还具有抑制多种肿瘤细胞增殖的功能，其多糖具有清除羟自由基的功能[9]，其蛋白质具有抗肿瘤、抗生育、抗蚜虫的功能。目前，半夏的市场需求量越来越大，而生产上由于种苗供应不足，供需矛盾越来越突出，导致市场价格持续攀升。近年来，对半夏种苗快速繁殖技术的研究越来越多，人工种子研究也有报道[10]。半夏组织培养研究不仅有助于种苗生产，还有助于利用细胞工程工厂化生产药用成分，解决在半夏田间生长慢的问题。

本试验结果表明，中等浓度的激素水平有利半夏叶片愈伤组织诱导，较高浓度的激素反而抑制其叶片脱分化。2，4-D对半夏愈伤组织增殖有促进作用。叶片前期脱分化水平影响到后期愈伤组织的增殖，相对而言，脱分化水平越高，增殖效果越好。但是不同激素水平对愈伤组织增殖的效率存在差异。在暗培养中，同时观察到B1、B3培养基上最先出现根的生长，B3生根较多。

综合分析表明，适合半夏一次性成苗的培养配方为MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3.0 mg/L 2，4-D。此配方得到的半夏愈伤组织丛芽较多，长势较壮且长有根，且均能分化成苗。

参考文献：

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志.第13卷第2册[M]. 北京：科学出版社，1979.

[2] 毛子成，彭正松.半夏研究进展[J].江西科学，2002，20（1）：42-46.

[3] 程霞英，杨宗岐.半夏愈伤组织诱导优化研究[J].天津农业科学，2013，19（9）：4-6.

[4] 彭向前，张文会.半夏的分生组织培养与快速繁殖技术研究[J].井冈山大学学报（自然科学版），2011，32（2）：46-49.

[5] 杨玉珍，王西雨，胡如善，等.半夏的组织培养与快繁试验[J].山东农业科学，2010（1）：10-11.

[6] 马宗新.半夏的组织培养研究[J].安徽农学通报，2009，15（8）：40，232.

[7] LI W， XIE Y M， LUO C P， et al. Study on rapid propagation medium of atractylodes lances by orthogonal design[J].Agricultural Science & Technology，2012，13（1）：49-52.

[8] 曾万勇，李金华，王 智，等.铁皮石斛无菌萌发及小苗快繁培养条件研究[J].武汉工业学院学报，2012，31（3）：10-12，47.

[9] 郭辉娟，魏定国.半夏多糖提取工艺优化及其清除自由基能力研究[J].安徽农业科学，2010，38（34）：19341-19342，19345.

[10] 张苏锋.半夏人工种子的研究[J].信阳师范学院学报（自然科学版），1998，11（3）：281-282.