大豆根际解磷细菌的分离及筛选

李丽丽等

摘要：解磷菌对于提高土壤中可溶性磷的含量、促进植物对磷的吸收具有重要作用。利用PVK培养基对黑龙江省海伦、北安地区大豆根际土壤中的解磷细菌进行初筛，共分离得到8株具有解无机磷能力的菌株。利用NBRIP培养基进行摇瓶复筛，培养3 d后，根据摇瓶中上清液的可溶性磷量的高低，筛选出5株解磷能力较强的菌株。其中海伦Ⅳ号的解无机磷能力最强，其培养液上清中的溶磷量可提高约10倍。研究中的技术体系可有效获得溶磷的细菌菌株，为进一步开发细菌磷肥打下了基础。

关键词：解磷细菌；溶磷量测定；大豆

中图分类号： S154.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）13-3048-03

Isolation and Screening of Phosphate-solubilizing in the Rhizosphere of Soybean

LI Li-li1，2，3，LANG Jing4，YANG Hong-yi4，TAI Fei-fei4，LAI Yong-cai1

（1.Crop Tillage and Cultivation Institute， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150086，China；

2. Northeast Forestry University Postdoctoral Programme， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences Postdoctoral Programme， Harbin 150040，China； 3. Institute of Forestry Science of Heilongjiang Province， Harbin 150081，China；

4.College of Life Science， Northeast Forestry University， Harbin 150040，China）

Abstract：The phosphate-solubilizing bacteria in the soil play an important role for improving the phosphorus level in the soil and absorbing the phosphorus nutrition for plants. The phosphate-solubilizing bacteria （PSB） in the rhizosphere of soybean was isolated using modified PVK medium. Eight strains of PSB were isolated. Subsequently， 5 strains of high-effective PSB were isolated according to phosphorus level in supernatant of culture solution after 3-day incubation in a liquid medium NBRIP. Hailun Ⅳ was found to possess the highest phosphate-solubilizing ability among 5 strains under the screening conditions. The soluble P in the supernatant of the culture of Hailun Ⅳ increased about 10-fold. The screening system can efficiently obtain PSB and is helpful to develop PSB phosphorus fertilizer.

Key words： phosphate-solubilizing bacteria； determination of phosphorus content； soybean

某些微生物可将土壤中难溶性磷转化为植物可以吸收利用的有效磷，这些微生物被称为解磷微生物，其可提高土壤中磷的利用率，促进作物生长。此外，解磷微生物与植物根系分泌物有着密切关系，可以影响植物根系分泌，改善和缓解根际酸化等问题，使植物能适应不良环境[1]。因而开发以解磷微生物为基础的微生物肥料，可解决化学磷肥使用带来的环境污染问题，促进粮食增产。

早在二十世纪初，欧洲就相继有人研究了土壤中微生物转化磷的机制。1935年前苏联学者蒙基娜从土壤中分离到一种巨大芽孢杆菌，能分解核酸和卵磷脂，在十几年后该菌株被大量生产并广泛应用于前苏联和东欧各国[2]。20世纪50年代，中国从东北黑土和灰化土中分离出能分解有机磷的巨大芽孢杆菌。1950年，中国科学院前林业土壤研究所从东北黑土中分离出一株假单胞菌，后期相继开展了小规模应用增产研究[1]。陈华癸、刘荣昌等都曾分离到过解磷效果较好的菌株，后续进行了大田试验，增肥增产效果较明显[2]。近年来，国内较多科研单位在玉米、水稻、大豆等作物上开展了大规模解磷菌的筛选工作。

本研究采集黑龙江省北安和海伦地区的大豆根际土壤，制备土壤悬液，利用PVK培养基对其进行涂布分离和划线纯化，之后利用NBRIP培养基进行摇瓶培养复筛，最终筛选出高效解磷菌株，为大豆生物磷肥的制备奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 土壤样品

采用“抖根法”采集海伦、北安地区大豆根际土壤样品，将采集的土壤置于无菌袋内，置于冰箱冷藏保存。

1.2 解磷菌初筛

取10 g大豆根际土壤，与100 mL去离子水混匀。取上清液，稀释10倍，涂布于PVK平板[葡萄糖10 g，Ca3（PO4）25 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.1 g，MgSO4 0.1 g，KCl 0.2 g，MnSO4 0.002 g，FeSO4 0.002 g，酵母浸膏0.5 g，0.4% 溴酚蓝（pH 6.7）6 mL，琼脂18 g，去离子水定容1 000 mL）][3]。倒置于37 ℃培养箱中培养。对长出的菌落进行单菌落分离、划线培养纯化，划线传代培养5次。

1.3 含磷量测定

利用钼蓝比色法测量溶液中的含磷量，其原理是：在酸性的介质中，活性磷酸盐与钼酸铵生成钼酸黄，用抗坏血酸还原为磷钼蓝后，在882 nm波长下测定吸光度，此吸光度与活性磷含量成正比[4]。标准曲线的绘制：分别取0、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0 mL的3 μg/mL磷酸盐工作液置于离心管中，将其稀释至25 mL，然后加入1.5 mL的抗坏血酸和1.5 mL的钼酸铵-酒石酸锑钾，反应6 min后，利用分光光度计测定吸光值，记录数据。以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线[4]。

1.4 解磷菌的复筛

利用钼蓝比色法绘制可溶性磷的标准曲线，对摇瓶培养后获得的培养液的上清液进行同样的钼蓝显色试验，根据吸光度值的大小与标准曲线的公式换算得出磷浓度。取10 mL摇瓶培养3 d的NBRIP液体培养基[葡萄糖 10 g，Ca3（PO4）2 5 g，KCl 0.2 g，（NH4）2SO4 0.1 g，MgSO4 0.25 g，MgCl 5 g，去离子水定容1 000 mL]，置于50 mL离心管中，7 000 r/min离心10 min，每个离心管取上清液5 μL，用去离子水稀释到25 mL，设3个平行样。加入1.5 mL的钼酸铵-酒石酸锑钾混合溶液和1.5 mL的抗坏血酸，反应5 min，测其吸光度。每个样测3个平行值，记录数据，利用标准曲线的公式，换算出相应的可溶性磷的浓度。将解磷效果较好的菌株用去离子水稀释20倍，吸取100 μL涂布于PVK平板，长出单菌落后进行菌种保存。

2 结果与分析

2.1 PVK平板初筛

利用PVK平板，从北安和海伦大豆根际土样中共筛选得到8株菌株，这些菌株的溶磷圈均较大，但菌落外观形态有所差异，其透明圈均为无色。分别编号为北安Ⅰ、北安Ⅱ、北安Ⅲ、北安Ⅳ、海伦Ⅰ、海伦Ⅱ、海伦Ⅲ、海伦Ⅳ。

对不同菌株的菌落半径（d）、透明圈半径（D）进行测定，并计算透明圈半径与菌落半径的比值（表1）。由表1可知，北安Ⅲ号的D/d值最高，北安Ⅰ号的D/d值其次，海伦Ⅳ号的D/d值最低。根据筛选原理[5]，在该种筛选条件下，北安Ⅲ号的解磷能力可能最高，而海伦Ⅳ号的解磷能力可能最低。

2.2 NBRIP培养基摇瓶复筛

在NBRIP培养基中进行摇瓶培养过程中，不同菌株生长及解磷速度差异较大。经2 d培养，多数菌株培养液整体浑浊，但也有少数菌株培养液较清澈，蜂窝状的磷颗粒处于培养基底部，但经再培养1 d后，所有菌株培养液皆整体浑浊。

解磷细菌具有解磷效应，将其接种到NBRIP培养基，解磷细菌会将培养基中的无机磷分解为可溶性磷。如果接种入NBRIP培养基的菌种能在这种条件下具备解磷能力，则在培养过程中，培养基中可溶性磷的含量会上升。可溶性磷的含量上升的越多，其相应的菌种的解磷能力则越强。基于钼蓝比色法，获得了可溶性磷含量的标准曲线（图1）。将初筛得到8个菌株接种入NBRIP培养基，进行摇瓶培养，基于可溶性磷含量的标准曲线，根据吸光度换算出可溶性磷含量，不同菌株接种前后的可溶性磷含量见表2。根据培养液上清液中可溶性磷含量的增加量的大小，从8个菌株中筛选出5个培养液中可溶性磷含量较高的菌株。分别是北安Ⅰ号、北安Ⅲ号、海伦Ⅱ号、海伦Ⅲ号、海伦Ⅳ号。其中海伦Ⅳ号的解磷能力最强，在100 mL的NBRIP培养基中，可溶性磷含量增加了431.045～735.397 mg/L，平行样1大约是原来的可溶性磷含量的11倍。海伦Ⅱ号、海伦Ⅲ号、北安Ⅰ号、北安Ⅲ号的解磷能力也较强，可溶性磷含量最高增加超过200 mg/L。

3 小结与讨论

传统PVK平板筛选解磷微生物法是根据筛选平板上生长的菌落周围是否产生透明圈以及透明圈的大小来判断菌株是否具有解磷能力，以解磷能力大小来进行解磷微生物的分离和筛选[6]。由于该方法是建立在解磷菌株产酸的前提条件下，因此只有通过产酸机制了解解磷微生物，并且必须是能产生大量有机酸的解磷微生物才有可能被筛选出来[7]。由于不同微生物间产酸营养条件存在差异，所以采用此方法筛选到的可能是只适合在该条件下产酸的微生物，透明圈的大小也仅反映出筛选菌株产有机酸的能力，不能真实地反映菌株实际的解磷能力，也由此反映出如果仅采用PVK平板筛选法来研究土壤环境中的解磷微生物群落或确定某一解磷微生物菌株解磷能力的大小会存在很大的片面性。本研究中经初筛获得的菌株较少，可能与此有关。

在筛选过程中，总体上初筛和复筛的相关性较强，即菌株在初筛中的溶磷圈较大，其在复筛中的溶磷效果也较强。但海伦Ⅳ号菌株在初筛过程中的溶磷圈最小，而在复筛中的溶磷效果很好，可能是由于该菌株在不同的培养基中的生长代谢条件不同，即对培养条件和解磷对象有一定的专一性，以至于其解磷能力因培养环境的不同而不同。

在复筛过程中，菌株在NBRIP培养基中培养了3 d，之后进行测量可溶性磷量，但菌液中的可溶性磷含量可能并非皆在第二天达到顶峰。因而，对培养液内的磷含量进行7 d的监测并制备监测曲线，可对溶磷动态变化有更好的了解。总体上来看，经PVK平板初筛、NBRIP摇瓶复筛，该技术体系获得了可有效溶磷的细菌菌株，为进一步开发细菌磷肥打下了基础。

参考文献：

[1] 李晓婷.磷细菌K3的GFP标记与在土壤中定殖及对玉米生长效应研究[D].南京：南京农业大学，2009.

[2] 冯月红.苜蓿和小麦根际高效解磷细菌筛选及其溶磷效果的初步研究[D].兰州：甘肃农业大学，2003.

[3] LIU H， WU X， REN J， et al. Isolation and identification of phosphobacteria in poplar rhizosphere from different regions of China[J]. Pedosphere，2011，21（1）：90-97.

[4] 马 文.钼蓝法测定玉米浆中磷含量[J]. 安徽大学学报（自然科学版），1996（1）：123-126.

[5] 王英健.解磷细菌的分离纯化鉴定与生物学特性研究[J].安徽农业科学，2008，36（32）：13932-13933.

[6] PIKOVSKAYA R I. Mobilization of phosphates in soil in connection with the vital activities of some microbial species[J]. Mikrobiologiya， USSR，1948，17：362-370.

[7] 李文红，施积炎.西湖沉积物中解磷菌的分离纯化及其解磷能力[J].应用生态学报，2006，17（11）：2112-2116.

1.2 解磷菌初筛

取10 g大豆根际土壤，与100 mL去离子水混匀。取上清液，稀释10倍，涂布于PVK平板[葡萄糖10 g，Ca3（PO4）25 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.1 g，MgSO4 0.1 g，KCl 0.2 g，MnSO4 0.002 g，FeSO4 0.002 g，酵母浸膏0.5 g，0.4% 溴酚蓝（pH 6.7）6 mL，琼脂18 g，去离子水定容1 000 mL）][3]。倒置于37 ℃培养箱中培养。对长出的菌落进行单菌落分离、划线培养纯化，划线传代培养5次。

1.3 含磷量测定

利用钼蓝比色法测量溶液中的含磷量，其原理是：在酸性的介质中，活性磷酸盐与钼酸铵生成钼酸黄，用抗坏血酸还原为磷钼蓝后，在882 nm波长下测定吸光度，此吸光度与活性磷含量成正比[4]。标准曲线的绘制：分别取0、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0 mL的3 μg/mL磷酸盐工作液置于离心管中，将其稀释至25 mL，然后加入1.5 mL的抗坏血酸和1.5 mL的钼酸铵-酒石酸锑钾，反应6 min后，利用分光光度计测定吸光值，记录数据。以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线[4]。

1.4 解磷菌的复筛

利用钼蓝比色法绘制可溶性磷的标准曲线，对摇瓶培养后获得的培养液的上清液进行同样的钼蓝显色试验，根据吸光度值的大小与标准曲线的公式换算得出磷浓度。取10 mL摇瓶培养3 d的NBRIP液体培养基[葡萄糖 10 g，Ca3（PO4）2 5 g，KCl 0.2 g，（NH4）2SO4 0.1 g，MgSO4 0.25 g，MgCl 5 g，去离子水定容1 000 mL]，置于50 mL离心管中，7 000 r/min离心10 min，每个离心管取上清液5 μL，用去离子水稀释到25 mL，设3个平行样。加入1.5 mL的钼酸铵-酒石酸锑钾混合溶液和1.5 mL的抗坏血酸，反应5 min，测其吸光度。每个样测3个平行值，记录数据，利用标准曲线的公式，换算出相应的可溶性磷的浓度。将解磷效果较好的菌株用去离子水稀释20倍，吸取100 μL涂布于PVK平板，长出单菌落后进行菌种保存。

2 结果与分析

2.1 PVK平板初筛

利用PVK平板，从北安和海伦大豆根际土样中共筛选得到8株菌株，这些菌株的溶磷圈均较大，但菌落外观形态有所差异，其透明圈均为无色。分别编号为北安Ⅰ、北安Ⅱ、北安Ⅲ、北安Ⅳ、海伦Ⅰ、海伦Ⅱ、海伦Ⅲ、海伦Ⅳ。

对不同菌株的菌落半径（d）、透明圈半径（D）进行测定，并计算透明圈半径与菌落半径的比值（表1）。由表1可知，北安Ⅲ号的D/d值最高，北安Ⅰ号的D/d值其次，海伦Ⅳ号的D/d值最低。根据筛选原理[5]，在该种筛选条件下，北安Ⅲ号的解磷能力可能最高，而海伦Ⅳ号的解磷能力可能最低。

2.2 NBRIP培养基摇瓶复筛

在NBRIP培养基中进行摇瓶培养过程中，不同菌株生长及解磷速度差异较大。经2 d培养，多数菌株培养液整体浑浊，但也有少数菌株培养液较清澈，蜂窝状的磷颗粒处于培养基底部，但经再培养1 d后，所有菌株培养液皆整体浑浊。

解磷细菌具有解磷效应，将其接种到NBRIP培养基，解磷细菌会将培养基中的无机磷分解为可溶性磷。如果接种入NBRIP培养基的菌种能在这种条件下具备解磷能力，则在培养过程中，培养基中可溶性磷的含量会上升。可溶性磷的含量上升的越多，其相应的菌种的解磷能力则越强。基于钼蓝比色法，获得了可溶性磷含量的标准曲线（图1）。将初筛得到8个菌株接种入NBRIP培养基，进行摇瓶培养，基于可溶性磷含量的标准曲线，根据吸光度换算出可溶性磷含量，不同菌株接种前后的可溶性磷含量见表2。根据培养液上清液中可溶性磷含量的增加量的大小，从8个菌株中筛选出5个培养液中可溶性磷含量较高的菌株。分别是北安Ⅰ号、北安Ⅲ号、海伦Ⅱ号、海伦Ⅲ号、海伦Ⅳ号。其中海伦Ⅳ号的解磷能力最强，在100 mL的NBRIP培养基中，可溶性磷含量增加了431.045～735.397 mg/L，平行样1大约是原来的可溶性磷含量的11倍。海伦Ⅱ号、海伦Ⅲ号、北安Ⅰ号、北安Ⅲ号的解磷能力也较强，可溶性磷含量最高增加超过200 mg/L。

3 小结与讨论

传统PVK平板筛选解磷微生物法是根据筛选平板上生长的菌落周围是否产生透明圈以及透明圈的大小来判断菌株是否具有解磷能力，以解磷能力大小来进行解磷微生物的分离和筛选[6]。由于该方法是建立在解磷菌株产酸的前提条件下，因此只有通过产酸机制了解解磷微生物，并且必须是能产生大量有机酸的解磷微生物才有可能被筛选出来[7]。由于不同微生物间产酸营养条件存在差异，所以采用此方法筛选到的可能是只适合在该条件下产酸的微生物，透明圈的大小也仅反映出筛选菌株产有机酸的能力，不能真实地反映菌株实际的解磷能力，也由此反映出如果仅采用PVK平板筛选法来研究土壤环境中的解磷微生物群落或确定某一解磷微生物菌株解磷能力的大小会存在很大的片面性。本研究中经初筛获得的菌株较少，可能与此有关。

在筛选过程中，总体上初筛和复筛的相关性较强，即菌株在初筛中的溶磷圈较大，其在复筛中的溶磷效果也较强。但海伦Ⅳ号菌株在初筛过程中的溶磷圈最小，而在复筛中的溶磷效果很好，可能是由于该菌株在不同的培养基中的生长代谢条件不同，即对培养条件和解磷对象有一定的专一性，以至于其解磷能力因培养环境的不同而不同。

在复筛过程中，菌株在NBRIP培养基中培养了3 d，之后进行测量可溶性磷量，但菌液中的可溶性磷含量可能并非皆在第二天达到顶峰。因而，对培养液内的磷含量进行7 d的监测并制备监测曲线，可对溶磷动态变化有更好的了解。总体上来看，经PVK平板初筛、NBRIP摇瓶复筛，该技术体系获得了可有效溶磷的细菌菌株，为进一步开发细菌磷肥打下了基础。

参考文献：

[1] 李晓婷.磷细菌K3的GFP标记与在土壤中定殖及对玉米生长效应研究[D].南京：南京农业大学，2009.

[2] 冯月红.苜蓿和小麦根际高效解磷细菌筛选及其溶磷效果的初步研究[D].兰州：甘肃农业大学，2003.

[3] LIU H， WU X， REN J， et al. Isolation and identification of phosphobacteria in poplar rhizosphere from different regions of China[J]. Pedosphere，2011，21（1）：90-97.

[4] 马 文.钼蓝法测定玉米浆中磷含量[J]. 安徽大学学报（自然科学版），1996（1）：123-126.

[5] 王英健.解磷细菌的分离纯化鉴定与生物学特性研究[J].安徽农业科学，2008，36（32）：13932-13933.

[6] PIKOVSKAYA R I. Mobilization of phosphates in soil in connection with the vital activities of some microbial species[J]. Mikrobiologiya， USSR，1948，17：362-370.

[7] 李文红，施积炎.西湖沉积物中解磷菌的分离纯化及其解磷能力[J].应用生态学报，2006，17（11）：2112-2116.

1.2 解磷菌初筛

取10 g大豆根际土壤，与100 mL去离子水混匀。取上清液，稀释10倍，涂布于PVK平板[葡萄糖10 g，Ca3（PO4）25 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.1 g，MgSO4 0.1 g，KCl 0.2 g，MnSO4 0.002 g，FeSO4 0.002 g，酵母浸膏0.5 g，0.4% 溴酚蓝（pH 6.7）6 mL，琼脂18 g，去离子水定容1 000 mL）][3]。倒置于37 ℃培养箱中培养。对长出的菌落进行单菌落分离、划线培养纯化，划线传代培养5次。

1.3 含磷量测定

利用钼蓝比色法测量溶液中的含磷量，其原理是：在酸性的介质中，活性磷酸盐与钼酸铵生成钼酸黄，用抗坏血酸还原为磷钼蓝后，在882 nm波长下测定吸光度，此吸光度与活性磷含量成正比[4]。标准曲线的绘制：分别取0、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0 mL的3 μg/mL磷酸盐工作液置于离心管中，将其稀释至25 mL，然后加入1.5 mL的抗坏血酸和1.5 mL的钼酸铵-酒石酸锑钾，反应6 min后，利用分光光度计测定吸光值，记录数据。以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线[4]。

1.4 解磷菌的复筛

利用钼蓝比色法绘制可溶性磷的标准曲线，对摇瓶培养后获得的培养液的上清液进行同样的钼蓝显色试验，根据吸光度值的大小与标准曲线的公式换算得出磷浓度。取10 mL摇瓶培养3 d的NBRIP液体培养基[葡萄糖 10 g，Ca3（PO4）2 5 g，KCl 0.2 g，（NH4）2SO4 0.1 g，MgSO4 0.25 g，MgCl 5 g，去离子水定容1 000 mL]，置于50 mL离心管中，7 000 r/min离心10 min，每个离心管取上清液5 μL，用去离子水稀释到25 mL，设3个平行样。加入1.5 mL的钼酸铵-酒石酸锑钾混合溶液和1.5 mL的抗坏血酸，反应5 min，测其吸光度。每个样测3个平行值，记录数据，利用标准曲线的公式，换算出相应的可溶性磷的浓度。将解磷效果较好的菌株用去离子水稀释20倍，吸取100 μL涂布于PVK平板，长出单菌落后进行菌种保存。

2 结果与分析

2.1 PVK平板初筛

利用PVK平板，从北安和海伦大豆根际土样中共筛选得到8株菌株，这些菌株的溶磷圈均较大，但菌落外观形态有所差异，其透明圈均为无色。分别编号为北安Ⅰ、北安Ⅱ、北安Ⅲ、北安Ⅳ、海伦Ⅰ、海伦Ⅱ、海伦Ⅲ、海伦Ⅳ。

对不同菌株的菌落半径（d）、透明圈半径（D）进行测定，并计算透明圈半径与菌落半径的比值（表1）。由表1可知，北安Ⅲ号的D/d值最高，北安Ⅰ号的D/d值其次，海伦Ⅳ号的D/d值最低。根据筛选原理[5]，在该种筛选条件下，北安Ⅲ号的解磷能力可能最高，而海伦Ⅳ号的解磷能力可能最低。

2.2 NBRIP培养基摇瓶复筛

在NBRIP培养基中进行摇瓶培养过程中，不同菌株生长及解磷速度差异较大。经2 d培养，多数菌株培养液整体浑浊，但也有少数菌株培养液较清澈，蜂窝状的磷颗粒处于培养基底部，但经再培养1 d后，所有菌株培养液皆整体浑浊。

解磷细菌具有解磷效应，将其接种到NBRIP培养基，解磷细菌会将培养基中的无机磷分解为可溶性磷。如果接种入NBRIP培养基的菌种能在这种条件下具备解磷能力，则在培养过程中，培养基中可溶性磷的含量会上升。可溶性磷的含量上升的越多，其相应的菌种的解磷能力则越强。基于钼蓝比色法，获得了可溶性磷含量的标准曲线（图1）。将初筛得到8个菌株接种入NBRIP培养基，进行摇瓶培养，基于可溶性磷含量的标准曲线，根据吸光度换算出可溶性磷含量，不同菌株接种前后的可溶性磷含量见表2。根据培养液上清液中可溶性磷含量的增加量的大小，从8个菌株中筛选出5个培养液中可溶性磷含量较高的菌株。分别是北安Ⅰ号、北安Ⅲ号、海伦Ⅱ号、海伦Ⅲ号、海伦Ⅳ号。其中海伦Ⅳ号的解磷能力最强，在100 mL的NBRIP培养基中，可溶性磷含量增加了431.045～735.397 mg/L，平行样1大约是原来的可溶性磷含量的11倍。海伦Ⅱ号、海伦Ⅲ号、北安Ⅰ号、北安Ⅲ号的解磷能力也较强，可溶性磷含量最高增加超过200 mg/L。

3 小结与讨论

传统PVK平板筛选解磷微生物法是根据筛选平板上生长的菌落周围是否产生透明圈以及透明圈的大小来判断菌株是否具有解磷能力，以解磷能力大小来进行解磷微生物的分离和筛选[6]。由于该方法是建立在解磷菌株产酸的前提条件下，因此只有通过产酸机制了解解磷微生物，并且必须是能产生大量有机酸的解磷微生物才有可能被筛选出来[7]。由于不同微生物间产酸营养条件存在差异，所以采用此方法筛选到的可能是只适合在该条件下产酸的微生物，透明圈的大小也仅反映出筛选菌株产有机酸的能力，不能真实地反映菌株实际的解磷能力，也由此反映出如果仅采用PVK平板筛选法来研究土壤环境中的解磷微生物群落或确定某一解磷微生物菌株解磷能力的大小会存在很大的片面性。本研究中经初筛获得的菌株较少，可能与此有关。

在筛选过程中，总体上初筛和复筛的相关性较强，即菌株在初筛中的溶磷圈较大，其在复筛中的溶磷效果也较强。但海伦Ⅳ号菌株在初筛过程中的溶磷圈最小，而在复筛中的溶磷效果很好，可能是由于该菌株在不同的培养基中的生长代谢条件不同，即对培养条件和解磷对象有一定的专一性，以至于其解磷能力因培养环境的不同而不同。

在复筛过程中，菌株在NBRIP培养基中培养了3 d，之后进行测量可溶性磷量，但菌液中的可溶性磷含量可能并非皆在第二天达到顶峰。因而，对培养液内的磷含量进行7 d的监测并制备监测曲线，可对溶磷动态变化有更好的了解。总体上来看，经PVK平板初筛、NBRIP摇瓶复筛，该技术体系获得了可有效溶磷的细菌菌株，为进一步开发细菌磷肥打下了基础。

参考文献：

[1] 李晓婷.磷细菌K3的GFP标记与在土壤中定殖及对玉米生长效应研究[D].南京：南京农业大学，2009.

[2] 冯月红.苜蓿和小麦根际高效解磷细菌筛选及其溶磷效果的初步研究[D].兰州：甘肃农业大学，2003.

[3] LIU H， WU X， REN J， et al. Isolation and identification of phosphobacteria in poplar rhizosphere from different regions of China[J]. Pedosphere，2011，21（1）：90-97.

[4] 马 文.钼蓝法测定玉米浆中磷含量[J]. 安徽大学学报（自然科学版），1996（1）：123-126.

[5] 王英健.解磷细菌的分离纯化鉴定与生物学特性研究[J].安徽农业科学，2008，36（32）：13932-13933.

[6] PIKOVSKAYA R I. Mobilization of phosphates in soil in connection with the vital activities of some microbial species[J]. Mikrobiologiya， USSR，1948，17：362-370.

[7] 李文红，施积炎.西湖沉积物中解磷菌的分离纯化及其解磷能力[J].应用生态学报，2006，17（11）：2112-2116.