两种南海海绵放线菌的分离和培养研究

欧阳永长　梁梓添　姚雅琪　冯颖　王鹏飞

摘要：利用3种培养基对两种南海海绵Axinyssa和Halichondria共附生的放线菌（Actinobacterial）进行分离和培养，共得到41个放线菌菌株，分别属于Brachybacterium、Janibacter、Dermacoccus、Brevibacterium、Saccharomonospora、Arthrobacter、Micromonospora、Tsukamurella和Streptomyces 9个属的14个种，其中Y12和Y13为候选新种属。这些放线菌能抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的生长，其分子方法显示这些放线菌具有产生聚酮类化合物和非核糖体多肽的潜力。

关键词：海绵；微生物多样性；放线菌（Actinobacterial）

中图分类号：Q93 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）13-3002-04

Isolating Actinobacteria from Two Marine Sponges of the South China Sea

OUYANG Yong-chang，LIANG Zi-tian，YAO Ya-qi，FENG Ying，WANG Peng-fei

（Department of Biotechnology，Guangzhou Medical College，Guangzhou 510182， China ）

Abstract： 41 strains of actinomycetes were isolated from two marine sponges collected from the South China Sea by 3 culture medium. Based on sequencing 16S rRNA genes， these isolates were divided into 9 groups initially identified as genera Brachybacterium， Janibacter， Dermacoccus， Brevibacterium， Saccharomonospora， Arthrobacter， Micromonospora， Tsukamurella and Streptomyces by phylogenetic analysis. Among them， Y12 and Y13 may be new genera. All isolates could restrain the growth of Staphylococcusaureus，Bacillus subtilis and Escherichia coli， and had potential to produce polypeptide and nonribosomal peptide.

Key words： marine sponge； diversity of bacteria； actiobacteria

随着多抗性病原菌的流行，开发新抗生素的需求越来越迫切。放线菌（Actinobacterial）富产的次生代谢产物是抗生素开发的重要资源。目前，超过100个应用于农业和人类疾病治疗的抗生素来源于放线菌[1]。但随着研究的深入从放线菌中发现新次生代谢产物越来越难，主要原因之一是缺乏新放线菌资源。为寻找新的放线菌，21世纪以来研究者开始将目光投向独特的海洋环境，迄今已从海洋样品中培养出海洋专属的放线菌，如Salinispora等，并从其中发现了新颖的化合物Salinosporamide A[2]。

海绵属多孔动物门，与其共附生的微生物丰富，富含活性产物。目前从海绵中分离得到的活性代谢产物占已发现海洋天然产物的40%，海绵已成为最大的新药候选分子来源[3]。从海绵中得到的大部分活性产物来源于与其共附生的微生物。Zhang等[4]和Jiang等[5]的研究表明海绵富含新放线菌资源，但只有很少一部分微生物能在实验室培养，剩余绝大部分是未培养的微生物资源。本试验对中国南海两种海绵中可培养的放线菌进行研究，获得了多样性丰富的放线菌，其中包括多株候选新种，分子试验和抑菌活性筛选表明，这些放线菌富产聚酮和非核苷酸多肽等活性产物。

1 材料与方法

1.1 试验材料

两种海绵采自中国南海三亚海区（18.3°N，109.5°E），经鉴定分别属于Axinyssa和 Halichondria两个属。海绵样品经低温保存后于实验室处理。

1.2 放线菌的分离与培养

取海绵5 g，用无菌水冲净表面泥沙后置于培养皿中，再用无菌水漂洗6次，最后将其置于研钵中， 加5 mL无菌生理盐水制成匀浆液。将匀浆液10倍梯度稀释后，取10-3、10-4、10-5稀释液200 μL分别均匀涂抹于M1、M2和M3 3种培养基上（含K2Cr2O7，50 μg/mL）。M1：海绵榨汁100 mL，胰蛋白胨4 g， 酵母提取物5 g，琼脂糖15 g，天然海水500 mL和去离子水 400 mL；M2：可溶性淀粉10 g，KNO3 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g， K2HPO4 0.25 g，CaCO3 0.01 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂糖20 g，去离子水1 000 mL；M3：100%甘油6 mL，精氨酸1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，琼脂糖20 g，去离子水1 000 mL。将培养基置于28 ℃环境下培养2～4周。根据菌体形态、颜色等条件挑取不同种类菌落进行分离培养，并提取DNA。DNA提取方法参照文献[6]进行。利用16S rDNA基因对分离所得菌株进行初步鉴定。扩增16S rDNA基因的引物为27F：5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1500 r：5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′，PCR体系参照Jiang等[5]的方法配制。PCR产物直接测序（上海美吉生物医药科技有限公司），所得序列与GenBank数据库进行比对，初步确定目的菌落的种属。

1.3 放线菌活性产物的初步评估

利用PCR方法检测放线菌是否拥有聚酮类（PKS）Ⅰ型、Ⅱ型和非核糖体合成多肽（NRPS）等化合物的合成基因。引物序列、PCR方法和过程参照Jiang等[5]的方法进行。利用平板法对放线菌进行抗菌活性测定。指示菌株主要包括两个革兰氏阳性菌株，分别为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和一个革兰氏阴性菌株大肠杆菌（Escherichia coli）。抑菌圈在1 mm以上时认为放线菌有抑制指示菌活性的作用。

1.4 方格星虫共附生菌的多样性分析

所有测序结果经嵌合体检测后提交GenBank数据库，并与其他序列进行比对，利用MEGA5.0软件中的Neighbor-Joining法构建系统进化树[7]。

2 结果与分析

2.1 放线菌的初步鉴定

从M1、M2和M3 3种培养基中共分离得到41个菌株。利用PCR 扩增出16S rDNA 基因，测序后与GenBank 中的核酸序列比对。16S rDNA基因分析表明，41个菌株分别属于Brachybacterium、 Janibacter、 Dermacoccus、 Brevibacterium、 Sacchaomon

ospora、Arthrobacter、Micromonospora、Tsukamurella和Streptomyces等 9个属的14个种（表1）。其中Y12和Y13 与已知菌的相似性低（分别为96.3%和94.9%），可能属于新菌属。

2.2 放线菌活性产物的初步评估

利用PKS和NRPS合成酶的基因片段对放线菌生产这两类物质的潜力进行分析，结果见表1。多数放线菌含有PKS或NPRS基因，其中B10、2d24和A16同时含有PKS Ⅰ、Ⅱ和NRPS合成基因。抗菌活性筛选试验同样显示多数放线菌（除B3和Y4外）能产生抑制金黄色葡萄球菌生长的活性物质，其中Y12和Y13放线菌对革兰氏阴性菌有明显的抑制作用。这表明分离所得的放线菌能够产生多种活性物质，并具有产生聚酮类和非核苷酸多肽的潜力。

2.3 序列提交和多样性分析

16S rDNA基因测序的结果经比对后选择代表性序列提交GenBank，序列号为KF746912-KF746915。利用MEGA 5.0软件对这些序列进行分析，采用邻接法，重复取样1 000次，构建的系统进化树如图1所示。

3 小结与讨论

海绵是过滤性捕食的多细胞无脊椎动物，其独特的捕食方式使其体内及体表共附生了大量的微生物，其中包括丰富的放线菌资源[8，12，13]。Webster等[8]利用原位杂交等手段证明了海绵Rhopaloeides odorabile中存在大量未培养的放线菌群落。为从海绵中获得新的抗生素资源，包括中国学者在内的多个研究团队对海绵Iotrochota sp.[5]、Hymeniacidon perleve[8]和Haliclona sp.[9]中的放线菌进行研究，从中分离得到了丰富的放线菌资源，其中还包括新的放线菌菌群，并且发现不同海绵有着特异的放线菌菌群。早前笔者对来自汕头海域的Haliclona sp.放线菌进行研究，从中分离得到Streptomycetaceae、Nocardiopsis和Micromonospora等10种放线菌。本试验中，笔者从来自三亚海域的Axinyssa和Halichondria两种海绵中分离得到41个放线菌菌株，分别属于Brachybacterium、Janibacter、Dermacoccus、 Brevibacterium、 Saccharomonospora、 Arthrobacter、Micromonospora、Tsukamurella和Streptomyces 9个属的14个种。其中Y23和Y12的16S rDNA基因序列与已培养的放线菌相似性低，表明其可能是新的放线菌属。从海绵Axinyssa中分离得到的放线菌菌落明显多于海绵Halichondria，且候选新菌和稀有放线菌绝大部分来自于前者。尽管分子生物学方法表明不同的海绵中都存在大量未培养的放线菌，但试验结果显示选择合适的海绵种类是获得新稀有放线菌的重要因素。

聚酮类化合物和非核糖体多肽是具有广泛生物活性的次生代谢产物[10]。尤其是聚酮类化合物，已知的聚酮化合物超过10 000个，如临床上应用的红霉素、四环素、利福平、两性霉素、阿霉素、洛伐他丁、FK506、雷帕霉素以及农牧业用阿弗菌素和莫能星、泰乐菌素等都属于这类化合物[10，11]。聚酮化合物由聚酮合成酶催化小分子羧酸经过缩合而成，通过分子方法对聚酮合成酶基因保守区域的检测可以评估放线菌产聚酮化合物的能力。为评价本试验中分离所得的放线菌活性产物的多样性，对放线菌的聚酮类化合物（PKSI、PKSII）和非核糖体合成多肽（NRPS）合成基因进行检测。同其他资源分离得到的放线菌一样[4，5，15，16]，本试验中放线菌绝大部分都含有聚酮化合物和非核糖体合成基因，具有产生这些化合物的潜力。同时抑菌试验表明这些放线菌大部分都能产生活性产物抑制革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌等的生长，其中小部分放线菌的活性产物还能同时抑制革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的生长。特别是菌株Y12和Y13，不仅具有合成PKS和NRPS的潜力，同时能产生抑菌活性产物，并且作为候选新菌具有更多机会获得新的次生代谢产物，这些放线菌的获得为新抗生素的开发积累了资源。

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