HPLC法测定肿节风中绿原酸、异嗪皮啶和迷迭香酸的含量

李锦燊，吴洪文(柳州市工人医院，柳州 545005)

肿节风系金粟兰科(Chloranthaceae) 草珊瑚属植物草珊瑚Sarcandraglabra(Thunb.) Nakai的干燥全草，又名九节茶、接骨木、草珊瑚，全株供药用，具有清热凉血、活血消斑、祛风通络的功效，用于血热发斑、发疹、风湿痹痛、跌打损伤等[1]。肿节风药材中的主要化学成分有黄酮类、萜类、香豆素类、酚酸类及有机酸类[2-3]。本实验建立高效液相色谱法同时测定肿节风中绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸含量的方法，目的是为了更好地控制肿节风药材的质量，保证临床用药安全有效。

1 仪器与试药

1.1仪器 LC-10ATVP高效液相色谱仪(日本岛津)；BP211D电子天平(德国Sartorius)；B2500S-MT型超声波清洗器(上海必能信超声有限公司) 。

1.2试药 迷迭香酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号111871-201102)；绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110753-200413，供含量测定用)；异嗪皮啶(中国药品生物制品检定所，批号110837-200304，供含量测定用)；乙腈(色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司)；其余均为分析纯。肿节风购自广西南宁生源中药饮片有限责任公司，经检测符合《中国药典》2010年版一部有关各项规定。

2 方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性 Phenomenex Gemini C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈(A)和4 mL·L-1磷酸水溶液(B)为流动相，采用梯度洗脱(0～15 min，10%A；15～16 min，10%～25%A；16～40 min，25%A)，流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长327 nm。在此条件下，肿节风药材中各色谱峰分离良好，见图1。理论板数按绿原酸、异嗪皮啶和迷迭香酸计算均大于3 000。

图1 高效液相色谱图

2.2对照品溶液的制备 分别取绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸对照品，精密称定，加甲醇并稀释到刻度，摇匀，制成质量浓度分别为0.448，0.172和0.186 g·L-1的混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备 取本品粉末(过4号筛)约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积分数60%甲醇50 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用体积分数60%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4线性关系考察 精密吸取对照品溶液 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加体积分数60%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列标准溶液。按2.1项的色谱条件分别进样10 μL，记录色谱峰面积Y，以峰面积Y对质量浓度X(mg·L-1)进行线性回归，绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸的线性方程分别为：Y=29 605X-5 311(r=0.999 9)；Y=199 360X+9 851(r=0.999 8)；Y=190 814X+26 537(r=0.999 9)，结果表明，它们分别在4.48～44.8，1.72～17.2和1.86～18.6 mg·L-1范围内线性关系良好。

2.5精密度实验 精密吸取同一标准溶液，连续进样6次，记录峰面积，结果绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸峰面积的RSD分别为0.73%，0.57%和1.12%。

2.6稳定性实验 取同一供试品溶液，分别在0，2，4，6，8和12 h进样，记录峰面积，结果绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸峰面积的RSD分别为1.30%，1.24%和0.99%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.7重复性实验 按2.3项下供试品溶液制备方法，取同一药材粉末，平行制备6份，测得峰面积并计算含量，结果绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸含量的RSD分别为1.56%，1.81%和1.15%，表明本方法重复性良好。

2.8加样回收率实验 取已知含量的肿节风粉末6份，每份约0.25 g，精密称定，添加混合对照品适量，按2.3项下方法制备供试品溶液并测定、计算，绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸的平均回收率分别为:101.5%，RSD 2.10%(n=6)；97.7%，RSD 2.71%(n=6)；99.3%，RSD 2.43%(n=6)。见表1至表3。

2.9样品测定 取不同批次的肿节风粉末，按2.3项下方法制备供试品溶液，测定其中绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸的含量，结果见表4。

表1 绿原酸加样回收率实验结果

表2 异嗪皮啶加样回收率实验结果

表3 迷迭香酸加样回收率实验结果

表4 肿节风药材中3种成分测定结果

3 讨论

本实验参考文献方法[4-5]选择乙腈(A)和4 mL·L-1磷酸水溶液(B) 为流动相进行梯度洗脱，先将绿原酸分离，再提高乙腈比例将异嗪皮啶和迷迭香酸洗脱出来；绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸的最大紫外吸收波长分别是327，340和330 nm，考虑到绿原酸的吸收系数比较小，所以选择327 nm作为检测波长。

目前，尚未见对肿节风中绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸3组分同时测定的文献报道。本实验利用高效液相色谱法同时测定3组分的含量，该方法简便、准确、重复性好，为肿节风药材提供了多成分测定方法，可用于其质量控制。

参考文献：

[1] 国家药典委员会．中国药典2010年版[S]．一部．北京：中国医药科技出版社，2010：207．

[2] 周斌，刘可越，常军，等．中药肿节风的化学成分和药理作用研究进展[J]．中国现代应用药学，2009，26(12)：982-985．

[3] 黄明菊．肿节风化学成分、生物活性及质量控制研究[D]．长沙：中南大学，2008．

[4] 尚飞，罗定强．HPLC法测定抗溶糖浆中绿原酸含量[J]．西北药学杂志，2011，26(5)：342-344．

[5] 黎雄，杨柳，曾星，等．HPLC测定清热消炎宁胶囊中异秦皮啶与迷迭香酸含量[J]．中国实验方剂学杂志，2010，16(11)：53-54．