超声灭活水中贾第鞭毛虫影响因素及机理研究

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(1.深圳信息职业技术学院 交通与环境学院，广东 深圳 518172；2.广东轻工职业技术学院 环境工程系， 广州 510300)

1 研究背景

贾第鞭毛虫(Giardia)是寄生于人和动物体内的一类肠道原虫。饮用了含有贾第鞭毛虫的水可引起严重的消化道感染，甚至死亡[1]。由贾第鞭毛虫引起的疾病称为贾第鞭毛虫病(Giardiasis)，常见症状为腹泻、腹痛和消化不良[2]。贾第鞭毛虫分布于世界各地，近10多年来，由于旅游事业的发展，在旅游者中发病率较高，故又称“旅游者腹泻”。起初，人类对贾第鞭毛虫的认识还不够深入，认为该虫只是一种共生性的肠道原虫。随着世界各地贾第鞭毛虫病的相继暴发和流行，其危害性不断显现，人类才真正开始了对该寄生原虫的深入研究。据世界卫生组织(WHO)估计，全世界人群贾第鞭毛虫感染率为1%～30%，儿童感染率最高。因此，该寄生原虫已经被世界卫生组织列为危害人类身体健康重要寄生虫之一[3]。

近几年，因为病原微生物污染而造成流行病爆发事件不断发生，如口蹄疫、SARS、甲型H1N1、禽流感等由病原体引起的流行病造成了大范围危害和社会恐慌。水环境污染或水系传播而引起的病原体感染仍然是当今世界上危害范围最广的环境问题。水媒性病原体主要包括原生动物、细菌和病毒，其中肠道感染病原体引发的案例最多。因此，我国在2006年12月颁布的新版《生活饮用水卫生标准》(GB 5749—2006)将贾第鞭毛虫列入需要检验的微生物指标之一[4]。

目前贾第鞭毛虫常用的灭活包括：氯气、二氧化氯、臭氧(臭氧/过氧化氢)、紫外线(Ultraviolet，UV)和光催化剂等[5-8]。贾第鞭毛虫外壁有一层很厚的孢囊对传统的加氯消毒有很强的抵抗性[9]，而加大消毒剂量又会导致水中致癌副产物增加[10]，严重危害人体健康。研究显示超声波对水体中的原声动物有很好的杀灭效果，而且没有致癌副产物生成，超声技术在消毒领域有很广泛的应用前景[11]。目前国内在此领域研究主要针对细菌和大肠菌群等，而鲜见应用于水中贾第鞭毛虫灭活的报道[12-13]。

2 材料与方法

2.1 试验装置与试验方法

试验装置如图1所示，该装置购于中国科学院声学研究所东海研究站。型号为TF2460A，可选频率20,40,60 kHz，功率(0～150)±2 W可调，容器直径8 cm，容器高度10 cm。

图1 超声反应装置示意图

反应容器置于水浴槽中，控制温度(25±1)℃，容器中加入虫样50 mL，其浓度为3×105个/mL，调节pH 7±0.2，超声频率19.8 kHz，超声功率151 W，反应时间10 min每隔1 min取样1 mL进行检测。每组进行3次平行试验，试验数据取平均值。

2.2 试验材料

贾第鞭毛虫(Giardia)采于患病犬，经过筛、硫酸锌漂浮和蔗糖梯度离心等步骤，得到浓度为5.0×106个/mL贾第鞭毛虫样品。以2.5%重铬酸钾悬浮保存于4℃冰箱。4,6-二脒基-2-苯基-吲哚(DAPI)，普匹碘胺(PI)，Hanks平衡盐溶液均购于Sigma (USA)。

2.3 分析方法

2.3.1 荧光染色法

采用荧光染色法[14-16]，所取样品4℃、10 000 r/min离心5 min，用HBSS平衡溶液漂洗3次；弃上清液于160 μL，加20 μL DAPI、20 μL PI使用液，37℃避光温浴1 h。取出样品再用HBSS平衡溶液漂洗3次，将未染上色的DAPI与PI洗掉。处理后样品涂片，在荧光显微镜下镜检，所用荧光显微镜为OLYMPUS BX-51 (Japan)。

DAPI会在450 nm紫外激发光下发出天蓝色荧光，而PI会在630 nm绿色激发光下发出亮红色荧光。DAPI能够透过细胞膜与DNA结合，而PI无法正常通过细胞膜，只有死亡的细胞才会被PI染色，因此可联合应用DAPI和PI判断贾第鞭毛虫的活性[17]。图2为DAPI及PI荧光显色照片。

图2 贾第鞭毛虫荧光染色照片

灭活率计算公式为

灭活率=PI+(DAPI+)+(PI+) ×100% 。

式中:PI+表示PI显色;(DAPI+)表示DAPI显色。

2.3.2 扫描电镜

扫描电镜(SEM)形态学研究采用HITACHI-S4700型(Japan)，样品用1.5 mL离心管装取，采用2.5%戊二醛固定，然后分别用50%,75%,90%,100%乙醇多次脱水，再分别用1∶1乙醇与醋酸异戊酯溶液和纯醋酸异戊酯置换，置换后的样品用针头挑出到叠好的称量纸中，放入干燥器中干燥12 h，最后用离子溅射镀膜仪喷金、检测。

3 结果与讨论

3.1 腐殖酸对超声灭活贾第鞭毛虫的影响

腐殖酸(Humic Acid, HA)是一种水环境中常见的高分子天然有机物，其来源主要是动植物残体经过一系列复杂的生物化学作用所形成的大分子有机物[18]。图3为温度(25±1)℃，超声频率19.8 kHz，功率151 W条件下，腐殖酸对US灭活贾第鞭毛虫的影响。

图3 腐殖酸对超声灭活贾第鞭毛虫的影响

从图中可知，腐殖酸浓度与超声灭活贾第鞭毛虫的灭活率呈负相关。超声作用10 min，腐殖酸浓度为0,1.0,2.0 mg/L时，灭活率分别为95.7%,93.8%和91.2%；腐殖酸浓度为20.0，50.0 mg/L时的灭活率分别为81.3%与80.6%。由上可知，随着腐殖酸浓度增加，灭活率不断下降，这可能是当腐殖酸分子在气相中或破碎的空化泡边界时，很容易受到羟自由基的轰击被氧化；而且，腐殖酸分子较容易进入空化泡的气相中，消耗了空化泡内部的羟自由基，在与贾第鞭毛虫的竞争中更具优势[19-20]，从而导致灭活率下降。

3.2 浊度对超声灭活贾第鞭毛虫的影响

浊度是一项重要的水质指标，天然水体由于含有大量的的悬浮物、胶体物质、浮游生物以及微生物会引起浊度的变化。本试验采用温度(25±1)℃，超声频率19.8 kHz，功率151 W，浊度在0～20.0 NTU范围内考察浊度对超声灭活贾第鞭毛虫的影响。

图4 浊度对超声灭活贾第鞭毛虫的影响

从图4中可以看出，当浊度为0 NTU时，超声10 min灭活率为95.7%。随浊度的增加，灭活率升高，当浊度为1.0 NTU时达到最佳灭活率(98.6%)。随着浊度逐渐增加，灭活率不断下降，浊度为2.0，5.0，10.0和20.0 NTU时，灭活率分别为95.2%，92.6%，90.8%和85.1%。究其原因，当浊度较低时，溶液中的微量颗粒会导致空化气泡发生不对称溃陷，使原先的气泡变为更多更微小的气泡，增加了单位时间，单位体积内空化泡的数量，即增加了空化作用的强度[21]。当浊度过大时，溶液中的悬浮物质会吸收声波的能量，使局部声强减弱导致空化作用降低[22]。

3.3 水中常见离子对超声灭活贾第鞭毛虫的影响

从图5(a)中可以看出，当超声作用10 min后，未添加Ca2+时灭活率为95.7%，当Ca2+浓度为1.0 mg/L时灭活率为96.3%，略高于未添加Ca2+的灭活率，其原因可能是少量的2价阳离子能够吸附在细胞表面，并能够打开某种“盐桥”使细胞内容物直接被攻击[23]。但随着Ca2+浓度逐渐增加灭活率下降，浓度为5.0，10.0，20.0 mg/L时，灭活率分别为92.8%，88.5%和86.2%，可见Ca2+在0～20.0 mg/L范围内对灭活的影响并不明显。

图5(b)为Zn2+对超声灭活贾第鞭毛虫的影响。Zn2+浓度0～20.0 mg/L并未明显地促进或抑制贾第鞭毛虫灭活率。从图5(b)中可看出，当超声作用10 min后，其中Zn2+为0 mg/L，灭活率为95.7%，当Zn2+浓度增加，分别为1.0,5.0,10.0,20.0 mg/L，灭活率为93.8%,92.5%,91.4%和90.9%。

3.4 超声灭活贾第鞭毛虫机制探讨

图6为超声(151 W，19.8 kHz)作用前后贾第鞭毛虫的扫描电镜(SEM)照片，其中图6(a)为超声之前的SEM照片，图6(b)、图6(c)分别为超声后的贾第鞭毛虫SEM照片。对比3张照片可以看到，未进行超声作用，贾第鞭毛虫形态较为完整，经过10 min超声之后照片中难以找到完整的；对比图6中的(a)，(b)可以明显看出，在超声前贾第鞭毛虫具有完整的椭圆结构，经过超声后细胞扭曲、变形，形态不再完整；经过10 min超声作用(图6(c))，细胞结构完全破坏；也可以说明超声灭活贾第鞭毛虫主要是超声破坏细胞的结构，从而导致贾第鞭毛虫失去活性。研究认为，超声的空化作用所产生的高速微射流的机械剪切作用是导致微生物失活的主要作用，超声可以完全破坏了大肠杆菌和酵母菌细胞结构[25-26]。而本文的扫描电镜结果说明：超声空化所产生的自由基氧化作用和超声过程中空化泡破裂所产生的高速微射流的机械剪切作用均是导致贾第鞭毛虫死亡的主要原因。

图6 超声作用贾第鞭毛虫前后扫描电镜照片

4 结 论

(1) 腐殖酸浓度与超声灭活贾第鞭毛虫的灭活率呈负相关，当腐殖酸浓度达到20.0 mg/L后，腐殖酸浓度对灭活率影响不大。

(2) 浊度对超声灭活贾第鞭毛虫影响较为显著，呈低浓度促进，高浓度抑制趋势，浊度在1.0 NTU时达到98.6%，随着浊度增加灭活率逐渐下降，原因是浊度较低时能增加空化作用的强度，浊度较高会吸收声波能量。

(4) 扫描电镜(SEM)进行的形态学观察可见，经过10 min的超声之后，视野中难以找到完整的贾第鞭毛虫细胞，表明超声的空化作用是导致贾第鞭毛虫失活的主要原因。

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