RP-HPLC法测定不同产地黄芩中5种黄酮苷元成分的含量

颜 梅，徐菲拉，徐 斌，何三民，梅新路（金华市中心医院，浙江金华 321000）

RP-HPLC法测定不同产地黄芩中5种黄酮苷元成分的含量

颜 梅＊，徐菲拉，徐 斌，何三民，梅新路#（金华市中心医院，浙江金华 321000）

目的：建立测定不同产地黄芩中5种黄酮苷元成分含量的方法。方法：采用反相高效液相色谱法。色谱柱为Agilent Extend-C18（150mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脱），检测波长为276 nm，流速为1.0m l/m in，柱温为35℃。结果：去甲汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A的进样量分别在0.018 0～0.108 0、0.378 0～2.268 0、0.094 5～0.567 0、0.022 5～0.135 0、0.035 4～0.212 4μg范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系（r分别为0.999 9、0.999 5、0.999 6、0.999 5、0.999 5）；精密度、重复性、稳定性试验的RSD＜3%；加样回收率分别为98.72%（RSD＝2.5%，n＝6）、101.80%（RSD＝2.0%，n＝6）、99.25%（RSD＝2.3%，n＝6）、98.71%（RSD＝1.5%，n＝6）、99.05%（RSD＝1.2%，n＝6）。结论：该方法操作简便、快速，结果准确，可用于黄芩中黄酮苷元成分的含量测定。

黄芩；黄酮苷元；含量测定；反相高效液相色谱法

＊药师。研究方向：中药鉴定。E-mail：415656073@qq.com

#通信作者：药师。研究方向：中药分析。E-mail：mei222331@163. com

黄芩最早记载于《神农本草经》，为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功效，是临床大宗使用的药材[1]。有关黄芩的传统研究多集中在黄芩苷类成分上[2-3]，而近年来有关黄芩中黄酮苷元类物质药理作用的研究有所增多：黄芩素有抗菌消炎、抗病毒、降低血清胆固醇等作用；汉黄芩素有抗氧化、抗肿瘤等生物活性；千层纸素A有抗肿瘤、神经保护等生物活性[4-8]。目前，有关黄芩中黄酮苷元的质量控制报道较少，因此笔者基于黄芩中苷类成分的含量测定方法，建立了一种同时测定黄芩中5种黄酮苷元成分含量的反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，为提高黄芩药材的质量标准提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1200系列HPLC仪（美国Agilent公司）；SK5200LH型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；AB204-N型精密分析天平（上海世义精密仪器有限公司）；HH-4型数显恒温水浴锅（金坛市荣华仪器制造有限公司）；鼓风干燥箱（上海市实验仪器厂有限公司）。

1.2 试剂

黄芩素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111595-200905）；白杨素、汉黄芩素、千层纸素A、去甲汉黄芩素对照品均为笔者自制（纯度均＞98%）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.3 药材

黄芩药材于2012年9月分别采自河北承德、陕西商洛、内蒙古赤峰、山东胶南、安徽亳州、甘肃天水（栽培）、甘肃天水（野生），经我院何三民主任中药师鉴定，1～5号为《中国药典》收载正品Scutellaria baicalensisGeorgi，6、7号为甘肃当地品种。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：AgilentExtend-C18（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；柱温：35℃；检测波长：276 nm；流速：1.0m l/min。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradientelution procedure

2.2 混合对照品溶液的制备

分别精密称取去甲汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A对照品适量，加入甲醇制备成每1m l分别含6、126、31.5、7.5、11.8µg的混合对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取黄芩粉末（过五号筛）5 g，置150m l带塞锥形瓶中，加水酶解后取出，用水补足减失的质量，再加入95%乙醇至含醇量为50%，滤过，滤液置250m l量瓶中，分别用提取溶剂少量多次洗涤容器和残渣，洗液并入量瓶中。精密量取0.2 m l，置25m l量瓶中，以甲醇定容，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 专属性试验

精密吸取对照品和供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录65min内的色谱图。结果显示，供试品中5种黄酮苷元成分都实现了良好分离，表明该方法稳定、可行。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；1.去甲汉黄芩素；2.黄芩素；3.汉黄芩素；4.白杨素；5.千层纸素-AFig 1 HPLC chromatogramsA.m ixed control；B.test samples；1.norepinephrine wogonin；2.baicalein；3.wogonin；4.chrysin；5.oroxylin-A

2.5 线性关系考察

分别精密吸取混合照品溶液3.0、6.0、9.0、12.0、15.0、18.0μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积积分值（y）为纵座标，进样量（x，μg）为横座标，进行线性回归，得去甲汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A的回归方程分别为y＝64.063x+0.673 3（r＝0.999 9，n＝6）、y＝37.731x－3.973 3（r＝0.999 5，n＝6）、y＝48.178x+0.133 3（r＝0.999 6，n＝6）、y＝59.949x+0.473 3（r＝0.999 5，n＝6）、y＝42.736x（r＝0.999 5，n＝6）。结果表明，上述5种成分的进样量依次在0.018 0～0.108 0、0.378 0～2.268 0、0.094 5～0.567 0、0.022 5～0.135 0、0.035 4～0.212 4μg范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。

2.6 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积，重复6次。结果显示，去甲汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A的RSD分别为1.2%、2.7%、1.2%、1.4%、1.3%、1.7%（n均为6），表明仪器精密度良好，

2.7 重复性试验

取黄芩粉末适量，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，再按上述色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，去甲汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A的平均百分含量分别为1.92%、8.47%、2.13%、0.1%、0.73%，RSD分别为1.3%、1.0%、0.5%、1.0%、1.2%（n均为6），表明本方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取同一供试品溶液适量，按上述色谱条件分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录峰面积。结果显示，去甲汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A的RSD分别为1.6%、1.1%、2.5%、2.5%、2.3%（n均为6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.9 加样回收率试验

取黄芩粉末适量，精密称定，共6份，分别精密加入混合对照品溶液适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件进样测定，记录峰面积，计算加样回收率。结果显示，去甲汉黄芩素的平均加样回收率为98.72%，RSD＝2.5%（n＝6）；黄芩素的平均加样回收率为101.80%，RSD＝2.0%（n＝6）；汉黄芩素的平均加样回收率为99.25%，RSD＝2.3%（n＝6）；白杨素的平均加样回收率为98.71%，RSD＝1.5%（n＝6）；千层纸素A的平均加样回收率为99.05%，RSD＝1.2%（n＝6），表明本方法准确度良好。

2.10 样品含量测定

取不同产地的黄芩药材粉末适量，精密称定，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件进样测定，记录峰面积，以峰面积计算样品中5种黄酮苷元成分的含量，结果见表2。

表2 不同产地黄芩中5种黄酮苷元成分的含量测定结果（%，n＝3）Tab 2 Results of content determ ination of flavonoid aglycone in S.baicalensis from different sources（%，n＝3）

3 讨论

本试验首次采用RP-HPLC法同时测定黄芩中5种黄酮苷元成分——去甲汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A的含量，并比较了7个产地黄芩药材的有效成分含量差异，与文献[9]相比，目标成分多，方法准确、简便、快速，重复性和分离效果好，可用于黄芩药材和其黄酮苷元的质量控制。

黄芩作为我国临床常用药材，由于产地及生长期限不同，各有效成分含量具有较大差异[10-11]。研究发现，仅以含量最高的黄芩素作为指标，不同产地药材的质量差异显著，由高到低依次为河北承德、内蒙古赤峰、山东胶南、陕西商洛、安徽亳州、甘肃天水（野生）、甘肃天水（栽培）；如将其他4种成分的含量同时作为评价指标，河北承德药材的质量最好。提示仅以单一成分作为质量控制的指标存在一定的局限性，需建立多种有效成分的含量测定方法才更容易全面控制药材质量。

本试验结果还表明，栽培黄芩和野生黄芩中的5种黄酮苷元成分含量总体上无明显差异，这可为黄芩药材的规范化种植提供依据；不同种属的黄芩中黄酮苷元成分含量差异较大，故临床应用应严格控制药材产地。

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[2] 徐楚江.中药炮制学[M].上海：上海科学技术出版社，1983：46.

[3] 宋扬文，陈忻.中药黄芩药理作用的研究进展[J].中国中医药科技，2010，17（4）：375.

[4] 宋旦哥，孟庆刚.黄芩药理作用研究述评[J].中华中医药学刊，2009，27（8）：1 619.

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[10] 田建红.不同产地黄芩中的有效成分含量分析[J].海峡药学，2009，21（3）：57.

[11] 丁芳林，张雯杰，陈波.HPLC测定不同产地黄芩中黄酮化合物的含量[J].中国现代中药，2008，7（10）：25.

Content Determ ination of 5 Kinds of Flavonoid Aglycone inScutellaria baicalensisfrom Different Sources by RP-HPLC

YAN Mei，XU Fei-la，XU Bin，HE San-m in，MEIXin-lu（Jinhua Central Hospital，Zhejiang Jinhua 321000，China）

OBJECTIVE：To establish themethod for the content determination of 5 kinds of flavonoid aglycone inScutellaria baicalensisfrom different sources.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The determination was performed on Agilent Extend-C18（150mm×4.6mm，5μm）column w ithmobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0m l/min.The detection wavelength was set at 276 nm，and column temperature was 35℃.RESULTS：The linear ranges of norepinephrine wogonin，baicalein，wogonin，chrysin and oroxylin-A were 0.018 0-0.108 0μg（r＝0.999 9），0.378 0-2.268 0 μg（r＝0.999 5），0.094 5-0.567 0μg（r＝0.999 6），0.022 5-0.135 0μg（r＝0.999 5）and 0.035 4-0.212 4μg（r＝0.999 5）.RSDs of precision，reproducibility and stability tests were all lower than 3%.The recovery rates were 98.72%for norepinephrine wogonin（RSD＝2.5%，n＝6），101.80%for baicalein（RSD＝2.0%，n＝6），99.25%for wogonin（RSD＝2.3%，n＝6），98.71%for chrysin（RSD＝1.5%，n＝6）and 99.05%for oroxylin-A（RSD＝1.2%，n＝6）.CONCULSIONS：Themethod is simple，rapid and accurate，and it is feasible for content determination of flavonoid aglycone inS.baicalensis.

Scutelaria baicalensis；Flavonoid aglycone；Content determination；RP-HPLC

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2014）19-1782-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.19.18

2013-12-18

2014-04-05）