153例内蒙古汉族人群载脂蛋白（a）五核苷酸重复序列基因多态性与乳腺癌的关系＊

周 静，刘翠萍，韩明玥

（1.赤峰学院医学院分子生物教研室，内蒙古赤峰 024000；2.赤峰学院第一附属医院乳腺外科，内蒙古赤峰 024000）

脂蛋白（a）［Lp（a）］由蛋白质和脂类物质两部分组成，其中，脂类物质与低密度脂蛋白（LDL）相似，主要为胆固醇，而蛋白质部分由apoB－100和载脂蛋白［apo（a）］通过二硫键共价结合而成。apoB－100是疏水性蛋白质，部分被包埋于Lp（a）颗粒内部，分子量无明显个体差异，而编码apo（a）的基因具有多态性，且其表型具有地区种族差异性、受遗传基因控制、每一个个体的基因型是终身固定的，不会因身体状况而发生改变，因此，apo（a）的基因型决定了Lp（a）的特性。研究发现，位于apo（a）基因启动子区域上游信号序列五核苷酸（TTTTA）n重复序列（pentanucleotide repeat，PNR）的重复次数与血浆 Lp（a）浓度大致呈负相关，即重复数目多伴随低血浆Lp（a）浓度。

表1 健康对照与乳腺癌患者血脂水平比较（）

表1 健康对照与乳腺癌患者血脂水平比较（）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，与健康对照组比较。

组别 CH（mmol／L） TG（mmol／L） LDL－C（mmol／L） HDL－C（mmol／L） Lp（a）（mg／L）健康对照组 4.32±0.68 1.02±0.32 2.10±0.59 1.02±0.20 155.77±70.33乳腺癌组 4.89±0.47 1.45±0.91a 2.45±0.41 1.20±0.32a 245.12±142.57b

女性乳腺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，且近年来国内女性乳腺癌发病率越来越高。大量的研究已发现，肿瘤患者的血浆Lp（a）水平明显高于健康人群，特别是与性激素水平密切相关的恶性肿瘤患者血浆Lp（a）浓度增高更加明显［1］。另外，Yang等［2］也发现原发性肺癌男性患者血浆Lp（a）浓度的变化与癌症的发展具有相关性。那么在内蒙古地区汉族乳腺癌患者血浆Lp（a）水平是如何变化的呢？乳腺癌患者apo（a）PNR的等位基因及基因型分布的特点又是什么呢？

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究对象来源于赤峰学院第一附属医院乳腺外科明确诊断为乳腺癌的住院汉族患者（乳腺癌组），共计153例，平均年龄（52.37±6.28）岁。健康对照选自赤峰学院第一附属医院体检及在校学生未患动脉粥样硬化、肝脏疾病、糖尿病及癌症的健康汉族人群（健康对照组），共计143例，平均年龄（30.08±8.34）岁。

1.2 方法

1.2.1 血脂水平的测定 采集清晨空腹受检者EDTA－Na2抗凝静脉血4mL，及时分离血浆，密闭－20℃以下冰箱保存，5d内检测。血浆Lp（a）测定使用免疫透射比浊法，血浆总胆固醇（TG）、三酰甘油（TC）测定选用酶学终点分析法，血浆高密度脂蛋白胆固醇（HDL－C）采用磷钨酸－镁沉淀法进行测定，血浆低密度脂蛋白胆固醇（LDL－C）采用聚乙烯硫酸盐沉淀法进行测定。为确保测定结果可靠，每批标本测定均做标准曲线，同时做质控。

1.2.2 PCR扩增 血细胞经过0.2%的NaCl低渗溶液破碎红细胞，分离出白细胞后，用北京百泰克生物技术有限公司的细胞／组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并测定其浓度。

引物设计参照胡波等设计［3］，由北京三博远志生物技术有限责任公司合成，序列为上游：5′－GAA TTC ATT TGC GGA AAG ATT G－3′；下 游：5′－CTT AAC CGG GGT GAG AGT CTC－3′。特异性扩增apo（a）5′端调控信号区（TTTTA）n序列，序列长度约为100bp。

PCR扩增条件：94℃预变性90s；以下程序循环35次，94℃变性40s，60℃退火30s，72℃延伸40s；最后72℃再延伸5min，4℃保存。取产物3μL经3%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察电泳结果。

1.2.3 apo（a）PNR基因多态性的检测 按照丙烯酰胺：N、N′－甲叉双丙烯酰胺50.0∶2.5的比例配制10%的聚丙烯酰胺凝胶。150V4℃预电泳30min，加样1.5μL后再150V于4℃电泳10h。电泳结束后，凝胶首先在10%醋酸溶液中固定10min，蒸馏水冲洗1～2次后，于0.2%硝酸银溶液中染色10 min，水洗3～5次，再于含有0.4%甲醛的1.5%NaOH溶液中显色，最后用0.75%的Na2CO3溶液终止。染色后的凝胶用quantity one软件分析各条带相对分子质量。

1.2.4 DNA序列测定 挑选在聚丙烯酰胺凝胶电泳中apo（a）（TTTTA）串联重复序列数为5、8、9的纯合体样品各2个用pGEM－T载体克隆，送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件进行分析，计量资料以表示，apo（a）PNR等位基因和基因型频率采用基因计数法计算，组间等位基因与基因型频率比较采用χ2检验，组间血脂水平及组内不同基因型血脂水平比较均采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血脂水平比较 乳腺癌组与健康对照组各血脂水平比较，乳腺癌患者血浆TG、Lp（a）及 HDL－C水平均显著性高于健康对照组，见表1。

2.2 PCR扩增产物的检测 apo（a）5′端调控区信号密码子上游1373bp处的（TTTTA）n五核苷酸串联重复序列PCR扩增产物经3%琼脂糖凝胶电泳检测发现100bp处有单一条带，见图1。

图1 琼脂糖凝胶电泳检测结果

表2 健康对照组与乳腺癌组apo（a）PNR等位基因频率分布比较

2.3 等位基因与基因型频率分布 两组人群检测出分子量分别为81、91、96、101bp的PCR扩增产物，对应的五核苷酸重复次数分别为5、7、8、9共4种等位基因，其中，乳腺癌患者中检测出重复次数为5、8、9的3种等位基因，两组apo（a）PNR等位基因频率见表2。应用相对风险率（RR）Wolf公式＝ad／bc［a为携带（TTTTA）5的乳腺癌患者等位基因数目，b为不携带（TTTTA）5的乳腺癌患者等位基因数目，c为携带（TTTTA）5的健康人群等位基因数目，d为不携带（TTTTA）5的健康对照人群等位基因数目］［4］，评估apo（a）PNR基因多态性与乳腺癌发生的关联性时发现，（TTTTA）5的等位基因与乳腺癌的发生存在负相关（RR＝0.3030，χ2＝8.96，P＜0.05）。

表3 健康对照与乳腺癌组apo（a）PNR基因型频率分布比较

另外，两组人群检测出5／8、5／9、5／5、7／9、8／8、8／9、9／9共7种基因型，见图2，其中，乳腺癌患者中检测出5／8、5／9、5／5、8／8、8／9、9／9共6种基因型，两组apo（a）PNR基因型频率差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

乳腺癌患者中apo（a）PNR中8／8与8／9基因型的血浆Lp（a）水平分别为（232.12±99.05）mg／L和（215.27±80.38）mg／L，通过t检验比对发现无统计学意义，其他几种基因型病例数太少，未进行统计分析。

图2 apo（a）PNR基因多态性PCR产物图谱

3 讨 论

Lp（a）是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的独立危险因子，即血浆Lp（a）浓度高的人群更易患动脉粥样硬化。apo（a）作为Lp（a）重要的组成成分，其氨基酸组成及基因结构与纤溶酶原十分相似。因此，Lp（a）能够竞争性抑制纤溶酶原激活，干扰纤溶酶原与纤维蛋白、细胞外基质、内皮细胞、单核细胞及血小板结合，延缓血块溶解，从而加速动脉粥样硬化性疾病的进程，促进血栓的形成。本研究测定乳腺癌患者血浆Lp（a）平均水平为（245.12±142.57）mg／L显著性高于健康对照组，且接近于湖北地区汉族AS患者、冠心病患者的Lp（a）平均水平（239.9＋225.4）mg／L、（247＋225）mg／L［4］，及心肌梗死、脑梗死患者血浆Lp（a）的平均水平263mg／L和297mg／L［5］。因此，高血浆Lp（a）水平的乳腺癌患者更易形成血栓。血栓的形成有助于肿瘤细胞附着于血管壁，并为其快速增殖提供能量物质和生长因子，且可以保护肿瘤细胞不受到机体防御机制的识别，加快肿瘤细胞的转移，促进肿瘤细胞的增殖［6］。因此，乳腺患者机体内过高的血浆Lp（a）水平在一定程度上有助于肿瘤细胞的增殖与转移，应给予有效的降低血浆Lp（a）水平的治疗，但传统的降血脂药物对血浆Lp（a）水平的影响并不明显，Kyutoku等［7］开发了一种DNA疫苗能够有效地降低血浆Lp（a）水平。

本次实验测得乳腺癌患者Lp（a）的标准差高达142.57 mg／L，这是因为血浆Lp（a）水平在不同个体间的差异较大，同时也说明了，虽然高浓度的血浆Lp（a）水平在一定程度上有助于肿瘤细胞的增殖与转移，但肿瘤细胞的增殖与转移不一定伴随着高浓度的血浆Lp（a）水平。

本次研究发现，内蒙古地区汉族人群共存在4种apo（a）5′端PNR等位基因和7种基因型，分别为5、7、8、9和5／8、5／9、5／5、7／9、8／8、8／9、9／9，明显少于 Trommsdorff等［8］发现的黑种人、欧美白种人、胡波等［4］发现的湖北地区汉族人群及梁红艳等［9］发现的哈尔滨地区人群的等位基因和基因型的种类，但是序列重复数为8的等位基因频率均最高。这可能与apo（a）具有地区、种族的差异有关，也可能是那些基因型分布频率太低，未能被及时发现。本研究发现的4种等位基因中，乳腺癌患者（TTTTA）5等位基因频率明显低于健康对照组（P＜0.05），且（TTTTA）5等位基因与乳腺癌的发生呈负相关，但因乳腺癌患者中（TTTTA）5／病例数太少，因此未对其血浆Lp（a）水平进行统计分析。但胡波［4］、刘晓宁［5］、梁红艳等［9］均发现，apo（a）PNR（TTTTA）5等位基因与高血浆 Lp（a）水平相关。胡波等［10］还发现动脉粥样硬化性脑梗死、冠心病等患者（TTTTA）5等位基因频率显著性高于健康对照人群，且与疾病的发生密切正关联。

综上所述，研究结果可能说明携带（TTTTA）5等位基因的人群易患动脉粥样硬化性疾病，但因为乳腺癌的发生是遗传因素及环境因素共同作用的结果，（TTTTA）5等位基因的人群相对于本次实验发现的其他apo（a）PNR（TTTTA）n基因型而言不易患乳腺癌，但是携带（TTTTA）5等位基因的人群可能易患动脉粥样硬化性疾病，即血浆Lp（a）水平高的人群不易患乳腺癌，但是发病后，高浓度的血浆Lp（a）水平可能更有助于肿瘤细胞的增殖与转移，且患动脉粥样硬化性疾病的风险率也很高。因此，如果可以开展广泛的基因筛选的话，有助于人们了解自身易患疾病，从而及早采取干扰、预防等措施。

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