左卡尼汀抑制过氧化氢介导的NFATc3核转位*

戴红良， 黄 雷， 贾桂枝， 梁春光， 李 昕， 戚春玲

(辽宁医学院 1护理学院, 3生物化学与分子生物学教研室，辽宁 锦州 121001； 2锦州市食品药品检验所，辽宁 锦州 121000)

左卡尼汀是位于线粒体膜的机体内源性化合物，主要来源于肝肾合成以及体外的饮食摄入[1-2]。其基本作用是促进长链脂肪酸转运至线粒体进行β氧化，为机体供能[3]。除此之外，左卡尼汀还具有显著的抗氧化活性[4-5]。我们之前的研究发现，左卡尼汀可显著抑制过氧化氢(H2O2)诱导的心肌细胞凋亡，其抗凋亡机制与抑制Ca2+/钙调神经磷酸酶(calcineurin, CaN)信号级联有关[5-6]。胞浆活化T细胞核因子3(nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 3, NFATc3)是CaN下游的重要转录因子。本研究拟通过分析左卡尼汀对H2O2刺激下心肌细胞内NFATc3表达及分布的变化，进一步探讨其抗氧化损伤的机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1药物与试剂 左卡尼汀、胰蛋白酶、DMEM低糖培养基T和Hoechst 33258染料均购于Sigma；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所；细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒及BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所；NFATc3及β-actin I抗购于Santa Cruz；Lamin B I抗购于Pierce；辣根过氧化物酶(horseradish peroxide, HRP)标记的II抗购于Santa Cruz;FITC标记的II抗购自北京中杉金桥公司。

1.2动物 出生1～3dSprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠，雌雄不拘，由辽宁医学院实验动物中心提供。动物合格证号为SCXK(辽) 2003-0007。

2 方法

2.1心肌细胞培养 取出生1～3 d SD大鼠乳鼠，开胸取出心脏，用D-Hanks液冲洗3次后剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小的碎块，在37 ℃条件下，以0.8 g/L胰蛋白酶消化分离细胞。将消化完毕的细胞以差速贴壁法进行纯化后，置于含15%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞融合后，换以含0.4%胎牛血清的DMEM，继续培养24 h后，将细胞分组用于实验。

2.2细胞核蛋白及浆蛋白提取 取处理完成的细胞，弃去培养基，PBS冲洗后用细胞刮子刮下细胞后，然后按照核蛋白提取试剂盒步骤提取核蛋白与浆蛋白。

2.3Westernblotting提取细胞蛋白后，BCA法测定蛋白浓度。取30μg总蛋白，以样品缓冲液配平上样体积，沸水煮5min后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，待电泳完成后电转移至聚偏氟乙烯PVDF膜。用5%脱脂牛奶封闭1h，接着加NFATc3、β-actin及laminBI抗4 ℃孵育过夜。以含吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris-bufferedsalinewithTween20,TBS-T)充分洗膜后，以HRP标记的II抗室温孵育2h。TBS-T洗膜后，化学发光法显色。 利用NIHImageJ1.42软件对扫描的条带进行灰度分析。

2.4细胞免疫荧光分析 取处理完成的细胞，以4%多聚甲醛固定30 min。加入0.2% Triton X-100作用30 min。以2%标准血清室温封闭1 h。加入NFATc3 I抗于4 ℃孵育过夜。FITC标记的II抗室温孵育1 h。用Hoechst 33258复染细胞核，置于荧光显微镜下观察并拍照。

3 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示。组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 左卡尼汀对H2O2刺激下心肌细胞内NFATc3表达的影响

结果显示，H2O2、左卡尼汀及CaN特异性抑制剂环孢素A(cyclosporin A, CsA)均不影响NFATc3的表达,见图1。

Figure 1. Effect of L-carnitine and CsA on NFATc3 expression in rat cardiac myocytes under H2O2 stimulation. Mean±SD.n=3.

2 左卡尼汀对H2O2刺激下胞浆及胞核中NFATc3表达的影响

与正常组比较，H2O2处理12 h后心肌细胞胞浆内NFATc3的表达显著降低，而其在核内的表达则显著增加，左卡尼汀及CsA本身并不影响NFATc3在胞浆及胞核的表达，但这2种药物预处理均能显著抑制H2O2诱导的上述改变，见图2。

3 左卡尼汀对H2O2诱导的NFATc3核转位的影响

免疫荧光的结果显示， H2O2处理12 h显著诱导NFATc3由胞浆到胞核的转位；左卡尼汀及CsA本身不影响NFATc3的转位，但这2种药物均能阻止H2O2的促转位作用，见图3。

讨 论

氧化应激是指细胞内氧化及抗氧化系统失衡，从而导致氧化作用过度激活的一种病理状态。心肌受到损伤后，活性氧与自由基生成大大增加。已经证实，氧化应激在心肌缺血再灌注损伤、糖尿病性心肌病及心肌纤维化等病理过程中发挥着重要作用[7-9]。而应用抗氧化剂往往能够取得良好效果[10]。

在正常的生理状态下，Ca2+是细胞内重要的第二信使。而在病理状态下，细胞内的Ca2+异常升高(Ca2+超载)则会对细胞带来严重损伤。已有研究证实，活性氧/氮应激可以通过改变细胞内正常的Ca2+稳态过程，最终诱导细胞死亡[11]。在之前的研究中我们也发现，H2O2可诱发心肌细胞内的钙超载，引起心肌凋亡。并发现左卡尼汀可通过抑制Ca2+下游CaN的过表达抑制心肌细胞凋亡[5]。

Figure 2. Effect of L-carnitine and CsA on NFATc3 expression in cytoplasmic and nuclear fractions. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs H2O2 group.

CaN是细胞内钙离子执行功能的重要靶蛋白之一。CaN在H2O2诱导的心肌损伤中起着重要作用[5,12]。当CaN激活后，其可直接与转录因子NFATc3结合，使其发生去磷酸化，从而使其由胞质向胞核转位。介导凋亡相关基因的表达[13]。许多物质可通过影响NFATc3的表达和(或)转位发挥其生物学作用[14-15]。在本研究中，我们发现左卡尼汀虽然不能影响NFATc3的表达，却可显著抑制其自胞浆自胞核的转位。另外，本研究还发现CaN特异性抑

Figure 3. Effect of L-carnitine and CsA on NFATc3 nuclear translocation in rat cardiac myocytes under H2O2 stimulation (×400).

制剂CsA可显著抑制H2O2诱发的NFATc3核转位。提示该现象是CaN依赖的。既然左卡尼汀可抑制CaN的表达[5]，那么左卡尼汀抑制NFATc3核转位很可能是其抑制CaN表达的结果。

综上所述，左卡尼汀对H2O2诱发的NFATc3的细胞核转位呈现明显的抑制作用。左卡尼汀发挥其抗氧化应激损伤可能与此有关。

[参 考 文 献]

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