青蒿素对糖尿病大鼠肾组织NF-κB的DNA结合活性升高的抑制作用

周凤娇，苏彦君，张丽坤，张建勇，安志霞

(河北省石家庄市第二医院，河北 石家庄 050051)

青蒿素对糖尿病大鼠肾组织NF-κB的DNA结合活性升高的抑制作用

周凤娇，苏彦君，张丽坤，张建勇，安志霞

(河北省石家庄市第二医院，河北 石家庄 050051)

目的 探讨青蒿素对实验性糖尿病大鼠肾组织核因子-κB(NF-κB)的DNA结合活性升高的抑制作用。方法 选择雄性SD大鼠15只，随机分成正常对照组(A组)、糖尿病组(B组)及青蒿素治疗组(C组),采用腹腔单剂量注射链脲佐菌素(STZ)65 mg/kg方法建立糖尿病大鼠模型。C组给予青蒿素300 mg/(kg·d)腹腔注射。于实验第4周应用电泳迁移率改变分析(EMSA)法检测3组大鼠肾皮质细胞NF-κB的DNA结合活性，并观察实验大鼠肾脏的病理学变化。结果 B组大鼠肾细胞NF-κB的DNA结合活性显著上调；C组NF-κB的DNA结合活性显著较B组下降，肾脏组织的病理学损伤亦减轻。结论 青蒿素可明显改善糖尿病大鼠肾脏组织病理学改变，通过抑制糖尿病大鼠肾脏组织细胞NF-κB的DNA结合活性上调可能是相关作用机制之一。

糖尿病肾病；青蒿素；NF-κB；电泳迁移率改变分析

近年来流行病学研究表明，糖尿病发病率在全球迅速上升，使糖尿病肾病(DN)发病率逐年增加，目前在发达国家，糖尿病肾病已成为引起终末期肾衰竭(ESRD)的首要原因。高糖环境下众多因素可导致肾组织细胞增生肥大，从而启动糖尿病肾病早期病变。如何逆转增生肥大的肾组织细胞成为防治早期糖尿病肾病的关键问题之一。近年来大量研究证明，转录因子NF-κB磷酸化激活后调控下游靶基因转录，从而使肾组织细胞产生多种生长因子和细胞因子，参与肾组织细胞增生肥大，启动早期糖尿病肾病的发生，并参与病情进展[1-3]。本实验通过糖尿病大鼠腹腔注射青蒿素，观察青蒿素对糖尿病大鼠肾脏组织细胞NF-κB的DNA结合活性升高的影响，为糖尿病肾病的临床防治提供新的研究途径和干预手段。

1 实验资料

1.1 实验材料 雄性SD大鼠15只，体质量180～220 g；STZ购自Sigma；青蒿素购自成都伟辉生物科技有限公司；NF-κB双链寡核苷酸、T4多核苷酸激酶、凝胶移位测定系统购自Promega公司；抗P50、抗P65多克隆抗体购自圣克鲁斯生物技术公司；达优血糖仪购自广州达优医疗设备有限公司。所用缓冲液配方，buffer A (pH 7.9):0.5% NP-40,10 mmol/L KCl,10 mmol/L HEPES,1.5 mmol/L MgCl2,0.5 mmol/L DTT,0.5 mmol/L PMSF;buffer B:buffer A中去掉NP-40;buffer C(pH 7.9):0.5 mmol/L PMSF,10 mmol/L KCl,1.5 mmol/L MgCl2,20%甘油,0.2 mmol/L EDTA,20 mmol/L HEPES,0.5 mmol/L DTT;buffer D:KCl为400 mmol/L，余成分同buffer C。Gel loading buffer(10×)：0.2%溴酚蓝,40%甘油；TE buffer:10 mmol/L Tris base,1 mmol/L EDTA；高渗裂解液(pH 8.0)：24 mmol/L EDTA,75 mmol/L NaCl。

1.2 方法

1.2.1 模型制备及用药 实验大鼠随机分为正常对照组(A组)、糖尿病组(B组)及青蒿素治疗组(C组)，每组5只。采用大鼠腹腔单剂量注射STZ 65 mg/kg建立糖尿病大鼠模型，对照组只腹腔注射等剂量柠檬酸缓冲液。72 h后采集大鼠尾静脉血，使用达优血糖仪测血糖，血糖≥16.7 mmol/L表明实验用动物模型成功。青蒿素溶于二甲基亚砜(DMSO)中，从造模成功当天起，C组大鼠予以腹腔注射青蒿素300 mg/(kg·d)，A组与B组大鼠分别给予等量DMSO腹腔注射。实验大鼠均自由饮水及进食，都不应用任何降糖药物。

1.2.2 提取大鼠肾脏核蛋白成分 在实验进行到第4周时，各组实验大鼠予以处死。将实验大鼠右侧肾脏进行分离以后，切开肾静脉和动脉，在0～4 ℃环境下，采用0.1 mol/L PBS冲洗右侧肾脏，灌洗5 min。去掉右侧肾脏肾包膜，留取右侧肾脏部分肾皮质，质量300 mg，采用0.1 mol/L PBS在冰浴上漂洗，漂洗时间约3 min。之后再用3 mL buffer A将右侧部分肾脏皮质匀浆，再转离心管内冰浴10 min,低温离心10 min后，弃掉上清液，再加4 mL buffer B，混合均匀，再次低温离心10 min，弃掉上清液，加400 μL buffer B，混合均匀后予以冰浴30 min，转入离心管内予以低温20 000 g离心，时间15 min，留取上清液，此即为肾组织细胞核蛋白成分，将其放入离心管内-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 同位素标记结合探针 NF-κB双链探针的碱基序列为：5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′，其5'-末端采用T4多核苷酸激酶予以标记[γ-32P]ATP，应用乙醇沉淀获取纯化标记的寡核苷酸探针。详细步骤操作均按照说明书进行。

1.2.4 电泳迁移率改变分析 ①对照反应：设阴性对照和阳性对照。②特异性抑制结合反应：反应体系中需加入1.75 pmol未标记NF-κB探针。非特异性抑制结合反应：反应体系中加入1.75 pmol未标记AP-2探针。③抗体结合实验：反应体系中加入2 μg抗P50、抗P65多抗。④检测实验大鼠肾组织细胞NF-κB的DNA结合活性。5 μg核蛋白加入反应体系中，加入1.75 fmol标记NF-κB探针。具体步骤操作均严格按照说明书展开。反应产物经凝胶电泳，后-70 ℃予以放射自显影，时间48 h。采用软件分析电泳谱带，以吸光度与凝胶谱带面积乘积代表NF-κB的活性。

1.2.5 肾组织细胞病理改变 留取适量右肾皮质，予以10%甲醛溶液浸泡固定，制备石蜡切片，染色后光学显微镜下观察肾组织细胞病理改变。

2 结 果

2.1 NF-κB探针与NF-κB结合具有序列上的特异性 阳性对照反应证实所采用的实验手段能成功检测NF-κB与DNA结合的复合物。未标记NF-κB探针浓度达标记NF-κB探针浓度100倍时，可完全抑制蛋白与DNA复合物形成。同样浓度未标记的AP-2探针没有此种抑制作用。抗P50、抗P65多抗均导致蛋白-DNA复合物的超迁移，证实此复合物内存在NF-κB蛋白。

2.2 各组大鼠肾组织细胞NF-κB活性比较 NF-κB的DNA结合活性A组为189±19.21，B组为817±17.91，C组为376±20.71。B、C组活性明显高于A组，但与B组比较，C组活性明显下降，说明糖尿病大鼠肾细胞NF-κB活性显著上升(F=3 715.268,P=0.000)，青蒿素治疗组糖尿病大鼠肾细胞NF-κB的活性明显被抑制(P<0.01)。

2.3 实验大鼠肾细胞病理学改变 光学显微镜下，A组大鼠的肾小球毛细血管襻薄，肾小管结构未见明显异常；B组大鼠肾小球的面积变大，系膜区面积变宽，并且基底膜明显变厚，肾小管未见明显病变，且肾小球未见硬化；C组大鼠肾小球病理改变较对照组重，但明显轻于B组。

3 讨 论

糖尿病肾病是糖尿病常见的并发症之一，目前其发病机制尚不完全清楚。研究表明，炎症在糖尿病的发生发展中起重要作用，它是促进糖尿病血管病变的关键[4]。糖尿病肾病时肾脏的固有细胞、炎症细胞合成和分泌多种炎症递质如NF-κB、IL-6等，参与炎症反应，导致肾病的发生和发展。NF-κB是炎症启动、调节的关键核因子，不仅参与了多种炎症因子转录的调控，其活化后还能诱导许多因子的转录。 目前研究证明受NF-κB调控的基因主要有内皮素-1(ET-1)、白细胞介素-1(IL-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及血小板衍化生长因子(PDGF)等。此类细胞因子可组成庞杂的细胞因子网络，引起肾细胞肥大以及增殖，并使组织细胞胶原蛋白降解减少而其合成却增加，最终导致细胞外基质(ECM)增加，并发生病理性重建，启动早期糖尿病肾病的发生，并参与病情进展[5-7]。

近年来大量研究证实青蒿素具有广泛的药理作用，主要为抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗纤维化的作用[8-9]。本实验应用电泳迁移率改变分析方法，在体外证明了大于标记NF-κB双链探针浓度100倍以上的未标记结合探针能有效阻断蛋白-DNA复合物形成，而同样浓度的AP-2未标记结合探针，由于其未含NF-κB的特异DNA序列而没有此种抑制效果，抗P50、抗P65多抗均能引起蛋白-DNA复合物的超迁移，证明本研究应用的NF-κB探针特异性高，并且实验方法准确，数据可靠。

本实验表明，糖尿病大鼠肾组织细胞NF-κB的活性显著上升，通过腹腔注射青蒿素，糖尿病大鼠肾组织细胞NF-κB的活性受到明显抑制，并能缓解糖尿病大鼠肾脏病理学改变，减轻糖尿病大鼠肾皮质功能损伤。

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Inhibitory effect of artemisinin on the upregulation of DNA-binding activity of NF-κB in kidney tissue of diabetic rats

Zhou Fengjiao, Su Yanjun, Zhang Likun, Zhang Jianyong, An Zhixia

(The Second Hospital of Shijiazhuang City, Shijiazhuang 050051, Hebei, China)

Objective It is to investigate the inhibitory effect of artemisinin on the upregulation of DNA-binding activity of NF-κB in kidney tissue of experimental diabetic rats. Methods 15 male SD rats were selected and randomly divided into 3 groups: normal control group(A group), diabetic group(B group)，artemisinin treatment group(C group). The diabetic rat models were established by intraperitoneal injection with STZ 65 mg/kg. Group C was given artemisinin 300 mg/(kg·d) by intraperitoneal injection. The DNA-binding activity of NF-κB in the kidney cortex cells was detected by EMSA, while renal pathologic changes were observed after 4 weeks' treatment. Results The DNA-binding activity of NF-κB was significantly activated in renal cortices in group B, and the activity was partly reversed in group C. Accordingly, renal pathologic changes in group C were significantly improved. Conclusion Artemisinin can obviously improve the pathologic changes of renal tissue in diabetic rats, one of the correlated mechanism may partly through inhibiting the DNA-binding activity of NF-κB in renal cortices.

diabetic nephropathy; artemisinin; NF-κB; EMSA

周凤娇，女，主治医师，硕士研究生，研究方向为糖尿病肾病。

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.19.009

R-332

A

1008-8849(2014)19-2075-03

2013-12-20