4个马铃薯品种感染马铃薯纺锤块茎类病毒>(PSTVd)的症状

邱彩玲， 吕文河， 吕典秋， 白艳菊， 魏 琪，刘尚武， 董学志， 耿宏伟， 万书明， 魏峭嵘

(1. 东北农业大学,哈尔滨 150030；2.黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所,哈尔滨 150086)

4个马铃薯品种感染马铃薯纺锤块茎类病毒>(PSTVd)的症状

邱彩玲1,2， 吕文河1*， 吕典秋2*， 白艳菊1,2， 魏 琪2，刘尚武2， 董学志2， 耿宏伟2， 万书明2， 魏峭嵘1

(1. 东北农业大学,哈尔滨 150030；2.黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所,哈尔滨 150086)

马铃薯纺锤块茎类病毒在中国及世界许多国家都是检疫性病害，该病害可大幅度降低马铃薯产量和品质。根据植株及块茎的症状，汰除感病的马铃薯种薯，是控制PSTVd传播和危害的重要手段。本研究利用分子克隆及测序技术，分离并鉴定了PSTVd的分离物351-17，利用PSTVd田间接种技术，分别接种了4个黑龙江省常用的马铃薯品种‘夏坡地’、‘克新18’、‘荷兰15’和‘尤金’，对其侵染后第一代的株高、叶片、块茎外观和单株产量进行了调查，结果表明：4个供试马铃薯品种感染PSTVd后均表现出了一定的症状，其中‘克新18’在株高、叶片和块茎的症状方面最为明显，单株产量下降显著，表明其对PSTVd非常敏感。

PSTVd； 马铃薯品种； 症状

马铃薯纺锤块茎类病毒(Potatospindletuberviroid，PSTVd)在中国及其他诸多国家都是检疫性病害。PSTVd不仅能够侵染马铃薯，还能侵染番茄、茄子、灯笼果、鳄梨以及许多观赏植物[1-4]，是国内马铃薯生产上的一种重要病害。目前国内研究较多的是PSTVd对于马铃薯的危害，因为该病害在我国马铃薯产区已经普遍发生。马铃薯被PSTVd侵染后的症状表现不仅因品种而异，而且还与PSTVd的株系以及环境因素有关[5]。在脱毒马铃薯种薯生产过程中，根据植株及块茎的表现，在马铃薯花期和/或收获后进行田间和/或库房检测，来汰除感病的马铃薯种薯，是有效控制PSTVd传播蔓延和危害的重要手段。研究不同马铃薯品种被PSTVd感染后的症状表现，是评估病害损失的前提条件。本研究利用分子克隆及测序技术鉴定PSTVd，并利用PSTVd田间接种技术，分别接种黑龙江省常用的4个马铃薯品种，对侵染后第一代的株高、叶片、块茎的症状及单株产量等性状进行调查，比较不同品种之间的差异，以便为马铃薯脱毒种薯的田间检测、库房检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试品种及种薯级别

脱毒马铃薯原原种，由黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所提供，品种为‘夏坡地’、‘克新18’、‘荷兰15’和‘尤金’，原原种大小均一，重约5 g。

1.1.2 供试PSTVd分离物

2011年在哈尔滨田间采集经鉴定感染PSTVd的马铃薯块茎，品种为‘黑彩’，编号为351-17。块茎发芽后进试管保存，待后续试验使用。

1.2 方法

1.2.1 PSTVd鉴定及序列测定

采用农业行业标准《马铃薯纺锤块茎类病毒检测》(NY/T 1962—2010)[6]中规定的RT-PCR方法鉴定田间采集的样品，利用TIANGEN公司的离心柱型琼脂糖凝胶回收试剂盒对扩增的特异性产物进行回收，纯化。将回收产物连接到TaKaRa公司生产的pMD18-T载体中，次日将连接产物转化到TransGen Biotech生产的大肠杆菌 DH5α中，观察过夜培养的菌落。选取6个单菌落进行培养，将培养后得到的菌落进行鉴定，鉴定方法仍采用《马铃薯纺锤块茎类病毒检测》(NY/T 1962—2010)中规定的方法。重组质粒由上海生工生物工程公司进行序列测定，测定结果采用BioEdit Sequence Alignment Editor软件分析，并在GenBank中进行BLAST检索。

1.2.2 田间试验

2012年5月25日，在黑龙江省哈尔滨市道外区民主农业生态园防虫网室内播种上述供试品种，苗期(7月2日)接种上述经鉴定过的PSTVd(接种方法见1.2.4)，7月25日取植株上部叶片，利用核酸斑点杂交法(nucleic acid spot hybridization，NASH)[7]鉴定接种情况，没有接种成功的于8月4日再接种1次，10月8日收获。用NASH方法进一步鉴定2012年收获的块茎感染PSTVd情况。

2013年5月30日，按照2012年的田间布置方式，播种2012年收获的块茎(感染PSTVd的块茎)，花期调查株高、叶片症状，收获时测产并调查块茎外观等性状。

1.2.3 播种方式及数据处理

每个供试品种播种2行，每行20株，株行距为35 cm×70 cm，采用常规的施肥和田间管理方式，每个品种设立2行对照(接种健康叶片)，对照与接种PSTVd的植株间种植隔离行，田间管理时单独使用工具，除去地头等特殊位置的植株外，每个处理随机选取10株进行调查，用DPS 7.05进行数据统计分析。

1.2.4 接种

(1)磷酸盐缓冲液配制

溶液A：7.164 g Na2HPO4·12H2O，加蒸馏水定容至100 mL；溶液B: 3.121 g NaH2PO4·2H2O，加蒸馏水定容至100 mL。取6.1 mL溶液A+3.9 mL溶液B+190 mL无菌水，混匀即为10 mmol/L的磷酸盐缓冲液。

(2)接种物准备

称取0.1 g左右感染PSTVd分离物351-17的叶片，加入1 mL磷酸盐缓冲液，快速、充分研磨即为接种液，迅速用于接种。对照则选用健康马铃薯叶片代替感染PSTVd的叶片制备接种液。

(3)接种方式

首先在植株上部完全展开的叶片上均匀喷洒600目的金刚砂，蘸取接种液逆着叶片表皮毛的方向适度摩擦叶片，稍后用蒸馏水冲掉叶片表面的金刚砂，完成接种。

2 结果与分析

2.1 PSTVd序列测定结果

PSTVd 分离物351-17的6个克隆序列测定结果(图1)一致。该序列经GenBank进行BLAST比对，结果表明，与来自俄罗斯的PSTVd分离物Tver′-96(登录号：EU879923.1)最接近，相似度为99%。但Tver′-96在俄罗斯以外并没有报道，目前尚无致病力等相关信息。

图1 PSTVd分离物351-17全长cDNA核苷酸序列Fig.1 The full-length cDNA sequence of PSTVd isolate 351-17

2.2 株高

感染PSTVd后，所有品种植株高度均极显著降低(表1，图2和图3)。降低幅度从13.47%至45.34%不等，其中‘克新18’降低幅度最大，平均株高降低45.34%，仅达到33.40 cm。供试的4个品种接种PSTVd后与对照相比，总体降低幅度为30.11%，与对照(CK)相比，株高差异达极显著水平。

表1 株高和产量方差分析1)Table 1 Analysis of variance on plant height and tuber yield

1)**表示在1%水平下极显著，*表示在5%水平下显著。
*and**indicate significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

图2 马铃薯不同品种感染PSTVd后的株高Fig.2 Plant height of different potato varieties infected with PSTVd

图3 不同马铃薯品种感染PSTVd后的株高Fig.3 Plant height of different potato varieties infected with PSTVd

2.3 单株产量

4个品种感染PSTVd后单株产量均极显著降低(表1、图4)，总体单株产量降低了40.19%；每个品种感染PSTVd和对照相比差异都达极显著水平，但不同品种的降低幅度不同，‘克新18’仍然是降低幅度最大的品种，其单株产量降低了58.85%。

图4 不同马铃薯品种感染PSTVd的产量Fig.4 Tuber yield per plant of different potato varieties infected with PSTVd

2.4 叶片症状

图5为4个供试品种感染PSTVd后的叶片表现。从图5中可以看出，‘克新18’和‘荷兰15’的叶片皱缩相对比较严重，‘夏坡地’和‘尤金’表现相对较轻，与这些品种在株高上变化的差异相对一致。

图5 不同品种感染PSTVd后的叶片症状Fig.5 Leaf symptoms of different potato varieties infected with PSTVd

2.5 块茎症状

感染PSTVd后各品种的块茎均表现不同程度的变化，呈现出一定的品种特性(图6)。具体表现为：‘夏坡地’块茎变小，细长，芽眼突起非常明显，个别块茎出现龟裂，“姜状”畸形是本品种感染PSTVd的典型特征；‘克新18’块茎顶芽端变粗，脐部变细，块茎变长，变小，表皮严重龟裂，是本品种感染PSTVd的典型特征；‘荷兰15’块茎变细长，变小，未见明显表皮龟裂，部分芽眼突起，多数块茎呈现豌豆状，是本品种感染PSTVd的典型特征；‘尤金’块茎表皮龟裂，变小，变长，芽眼突起。

图6 不同品种马铃薯感染PSTVd后的块茎症状Fig.6 Tuber symptoms in different potato varieties infected with PSTVd

3 讨论

本研究通过对株高、叶片症状、单株产量和块茎外观的调查结果显示，供试的4个马铃薯品种感染PSTVd后，均表现出了植株矮化、叶片皱缩、块茎变小、产量降低和块茎畸形等症状。其中‘克新18’表现最为明显，株高降低幅度、叶片皱缩程度、产量降低幅度以及块茎的畸形表现均非常显著，表明该品种对PSTVd非常敏感。

由于试验条件有限，无法一次性研究更多的马铃薯品种感染PSTVd的表现，但从本研究中仍能总结出一些马铃薯感染PSTVd后的特点，比如，植株高度都下降，块茎有不同形式、不同程度的畸形以及产量降低等，可以为脱毒马铃薯种薯的田间检测和库房检测提供技术指导。

PSTVd侵染不同品种的马铃薯会引起不同的症状，本研究结果进一步验证了这一结论。但是，不同品种为何会表现出不同的症状，其机制有待于进一步研究。此外，本研究接种用的PSTVd分离物351-17的致病力尚不确定，对马铃薯症状表现的影响程度也不是十分清楚，后续试验将进一步对其致病性等进行研究，完善本研究的试验结果，更好地了解PSTVd与马铃薯品种的互作效应，为PSTVd的防控提供指导。

[1]Querci M, Owens R, Bartolini I, et al. Evidence for heterologous encapsulation ofPotatospindletuberviroidin particles ofPotatoleafrollvirus[J]. Journal of General Virology, 1997,78:1207-1211.

[2]Ward L I, Tang J, Veerakone S, et al. First report ofPotatospindletuberviroidin cape gooseberry(Physalisperuviana) in New Zealand[J]. Plant Disease, 2010, 94(4):479.

[3]Verhoeven J Th J, Botermans M, Roenhorst J W, et al. First report ofPotatospindletuberviroidin cape gooseberry(Physalisperuviana) from Turkey and Germany[J]. Plant Disease, 2009, 93(3)：316.

[4]Verhoeven J Th J, Jansen C C C, Roenhorst J W.Streptosolenjamesonii‘Yellow’, a new host plant ofPotatospindletuberviroid[J]. Plant Pathology，2008，57(2):399.

[5]Anon. EPPO Standars-Diagnostis protocols for regulated pests-PM7/33Potatospindletuberpospivivoid[J]. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin， 2004,31:257-269.

[6]中华人民共和国农业部种植业管理司. NY/T 1962-2010，马铃薯纺锤块茎类病毒检测[S/OL].农业部公告第1515号，2010.

[7]吕典秋，李学湛，于德才，等. 马铃薯类病毒(PSTVd)非放射性标记cDNA探针制备及其在检测上的应用[J]. 植物病理学报，2005，35(2):104-108.

SymptomsoffourpotatovarietiesinfectedwithPotatospindletuberviroid(PSTVd)

Qiu Cailing1,2, Lü Wenhe1, Lü Dianqiu2, Bai Yanju1,2, Wei Qi2,Liu Shangwu2, Dong Xuezhi2, Geng Hongwei2, Wan Shuming2, Wei Qiaorong1

(1.NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China; 2.Virus-freeSeedlingResearchInstituteofHeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150086,China)

Potatospindletuberviroid(PSTVd) is a quarantine disease in China and many other countries around the world. The disease can significantly reduce tuber yield and quality. Eliminating the infected seed potatoes according to the symptoms of plants and tubers is an important and useful measure to control the spread and hazard of PSTVd. Using molecular cloning and sequencing techniques, PSTVd 351-17 was isolated and identified. Four common potato varieties(‘Shepody’, ‘Kexin 18’, ‘Helan 15’ and ‘Youjin’) were inoculated with the PSTVd 351-17 in the fields. Plant height, symptom of leaf and tuber, as well as yield per plant were investigated on the first infected generation. The results indicated that all the four potato varieties showed some symptoms. Among the four varieties， The ‘Kexin 18’ showed obvious symptoms of plant height, leaf and tuber appearance and dramatically decreased yield per plant, so it is very sensitive to PSTVd.

PSTVd； potato variety; symptom

2013-12-23

：2014-03-25

哈尔滨市应用技术研究与开发项目(2013AE6AW059)；国家现代农业产业技术体系(CARS-10-P14)；黑龙江省杰出青年科学基金(JC 201018)

S 432.4

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.030

* 通信作者 E-mail:吕文河whlu@neau.edu.cn; 吕典秋smallpotatoes@126.com