非小细胞肺癌与EML4-ALK融合基因的关系及其检测方法

高杰  韦立新

[摘要] 目前，肺癌已经成为世界范围内发病率及死亡率最高的肿瘤之一。随着分子生物学研究的飞速进展，肺癌的内科治疗已经从传统的化疗、放疗发展为个性化的靶向治疗。针对多种靶基因突变的靶向治疗为肺癌患者延长生命、提高生活质量带来希望。此文就最新的非小细胞肺癌靶基因EML4-ALK相关问题进行综述。

[关键词] 肺癌；个性化治疗；基因；EML4-ALK融合基因；表皮生长因子受体

[中图分类号] R734.2   [文献标识码] A   [文章编号] 2095-0616（2014）09-40-06

Review of the study of EML4-ALK fusion protein of non-small cell lung cancer

GAO Jie  WEI Lixin

Department of Pathology, the General Hospital of PLA, Beijing 100853, China

[Abstract] Today, lung cancer is the most commonly diagnosed cancer and the leading causes of tumor-related deaths in the world. Along with the fast progress of molecular biology, the traditional treatment methods, chemotherapy and radiotherapy gradually have been development to individual therapy. Strategies to maximize treatment benefit have centered on individualizing treatment according to the molecular profile of the non-small cell lung cancer. This review describes the relative information of the newest oncogenic drivers, EML4-ALK fusion protein, have also been implicated as in the pathogenesis of the non-small cell lung cancer.

[Key words] Lung cancer; Individual therapy; Gene; EML4-ALK fusion protein; EGFR

目前，肺癌已经成为发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一。肺癌可以根据治疗手段的不同分为两大类：小细胞肺癌及非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌（NSCLC）的发病率所占比重高，约为60%~85%[1]。所以近些年有关非小细胞肺癌治疗方面的研究成为热点。自2000年以来，随着生物工程技术以及临床药理学的飞速发展，肺癌的治疗不再局限于手术治疗及干扰细胞生长周期的传统放化疗。某些特异性靶点的出现，使肿瘤的治疗进入到一个特异性高、不良反应轻的靶向治疗阶段，使越来越多的肺癌患者受益[2]。如近几年来，针对非小细胞肺癌重要靶点之一的EGFR基因突变而设计的EGFR酪氨酸激酶抑制剂的出现（tyrosine kinase inhibitors，TKI），如吉非替尼（Gefitinib）和厄洛替尼（Erlotinib）等可以通过对肿瘤细胞EGFR的特异性结合阻断细胞信号传导通路，从而达到抑制肿瘤细胞的增殖并促进其凋亡达到治疗目的[3]。然而，并非所有的NSCLC患者对于TKI的治疗表现出较好的疗效[4]。随着肺癌肿瘤分子生物学研究的深入，逐渐发现NSCLC患者中存在与EGFR突变及K-RAS突变不重叠的另外一个重要的酪氨酸激酶抑制剂的作用靶点——EML4-ALK融合基因[5]。此融合基因在NSCLC阳性表达的患者中可能受益于ALK抑制剂的治疗。本文中，我们将简要探讨非小细胞肺癌中EML4-ALK融合基因的分子基础及其各种检测方法的不同。

1 ALK抑制剂治疗的分子基础

ALK基因重排是于1994年首先在间变大细胞淋巴瘤（ALCL）AMS3细胞株中被发现的[6]，该基因是由1620个氨基酸组成的一种跨膜蛋白，它编码一种有结构性激酶活性的细胞质嵌合蛋白，属于胰岛素受体家族成员之一。之后该基因在炎性肌纤维母细胞瘤、神经母细胞瘤等肿瘤中陆续被发现。

直到2007年，日本学者Soda发现该融合基因与肺癌的关系，其在一位吸烟的肺癌患者的肿瘤组织内检测到了棘皮动物微管相关蛋白样4和间变性淋巴瘤激酶基因（EML4-ALK）发生基因融合而成的具有致瘤性的变异基因[7]。对NSCLC患者进行该融合基因表达情况的检测，同时经细胞实验证实ALK抑制剂可以通过浓度依赖的方式抑制转染该基因的BA/F3细胞生长，从而诱发凋亡的发生。这不仅证实了ALK变异基因对肺癌肿瘤细胞增殖中所起到的作用，也充分的支持其作为一种药物靶点的有效性[8]。

EML4-ALK融合基因的产生源于染色体的重排，发生部位在2号染色体短臂上。EML4由N'末端碱基区、疏松的棘皮动物微管相关蛋白样区（hydrophobic echinoderm microtubule-associated protein-like protein，HELP）及WD重复区三部分组成，属于棘皮动物微管相关蛋白样家族成员。在EML4-ALK融合基因中，EML4的N'末端碱基区、HELP及WD重复区与ALK的胞内近胞膜部位发生融合[9]。正常情况下，棘皮动物微管相关蛋白样4和间变性淋巴瘤激酶基因分别位于染色体的2p21-2p23两端；当基因重排时ALK基因和EML4基因在2号染色体N'末端发生倒位，产生了包含酪氨酸激酶（TK）活性的癌蛋白嵌合体，此改变是肺癌中最常见的ALK基因异常。目前，已经发现有27种EML4-ALK的融合变型体存在，21种变型体位于EML4端，因为EML4断裂可以存在于多个不同的外显子上（如2，6，13，14，15，17，18和20等）。在所有变型体中，ALK基因的TK区域均位于20号外显子。最常见的融合基因变型体为发生于EML4基因端的外显子1和3a/b。在肺非小细胞癌中，除了EML4-ALK融合基因外，还存在一些罕见的ALK融合情况被发现，如ALK与驱动蛋白家族成员5B基因（kinesin family member 5B， KIF5B）和原肌凝蛋白受体激酶融合基因（tropomyosin receptor kinase-fused gene， TFG）发生融合的情况。因此，ALK基因重排可能定义为一种对靶向激酶抑制敏感的肿瘤分子亚组。

另外，由于EML4-ALK融合基因与KRAS基因突变比较相似，又与EGFR突变不共同存在，因此有学者推测EML4-ALK融合基因的存在可能解释为又一个潜在的原发耐药机制。Shaw等发现在轻度或不吸烟且无EGFR突变的非小细胞肺癌患者中，约33%的患者EML4-ALK融合基因为阳性[10]。同时，他们还对53例非小细胞肺癌患者进行EGFR-TKI治疗，19例患者疗效显著，其中未检出EML4-ALK基因阳性，而在34例EGFR-TKI耐药者中检测出该融合基因检出率高达29%。另外，Koivunen[11]等发现厄洛替尼不能抑制EML4-ALK阳性的非小细胞肺癌细胞株H3122增殖。由此可以假设，EML4-ALK融合基因可能是EGFR-TKI原发性耐药的重要原因之一。

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2 克唑替尼的治疗

克唑替尼是一种口服小分子的ALK和c-MET酪氨酸激酶的共同抑制剂，可以抑制激活的ALK酪氨酸磷酸化。适用于非小细胞肺癌患者肿瘤组织内ALK基因检测阳性的患者。在一期临床研究中[12]，最初设计为包含MET基因扩增的肿瘤的扩大研究，此阶段研究显示具有显著的抗肿瘤活性，约为61%的患者获得客观有效性，中位PFS值为9.7个月。在二期临床研究中也获得了较为惊人的结果，由910名ALK阳性的非小细胞肺癌患者入组，这些患者之前至少接受过一个疗程化疗后再接受克唑替尼的治疗。这组患者总反应率达到了59.8%，中位PFS为8.1个月[13]。三期临床研究对比了克唑替尼和二线化疗药的情况。有347名ALK阳性患者入组观察，与化疗组对比克唑替尼治疗者有有利的PFS值（7.7个月），化疗组仅为3.0个月。2010年ASCO会议上报到早期临床试验针对EML4-ALK融和基因的药物PF-02341066对阳性人群有效率超过64%[14]。克唑替尼似乎具有很差的血脑屏障通透性，但临床试验中对于非小细胞肺癌晚期发生脑部转移的部分患者似乎可以受益。该药不仅具有令人肯定的疗效，同时还有较好的耐受性，有报道的相关副作用包括：恶心（46%），视力损伤（45%），呕吐（39%），和腹泻（29%），多数为1和2级的不良事件， 3到4级不良事件患者仅为15%（多数为丙氨酸氨基转移酶升高，呼吸困难，中性粒细胞减少症等）[15]。基于良好的临床试验结果及患者良好的耐受性，加快了克唑替尼应用于临床的步伐。继FDA批准克唑替尼作为治疗非小细胞肺癌ALK融合基因阳性的患者之后，我国于2013年初，中国食品药品总局（CFDA）也批准了该药用于临床。

随着治疗的深入，发现小于10%的ALK阳性患者应用该药仍然表现为疾病进程的进展，或者一些患者对治疗无任何反应或仅开始有反应。因此发现，克唑替尼与其他酪氨酸激酶抑制剂一样，即使在治疗有效的患者也会出现耐药性。新英格兰杂志发表一篇文章，该文献报道了1例对克唑替尼产生耐药的NSCLC患者，其肿瘤标本中发现了两种新发突变，可能与克唑替尼耐药有关[16]。患者为年轻不吸烟、Ⅳ期的腺癌患者，EGFR突变检测为阴性。于其癌细胞内检测出EML4-AlK融合基因存在，并接受克唑替尼治疗有效，治疗后5个月出现肿瘤进展。对其进行DNA测序和EML4-ALK突变体检测。发现两处碱基（碱基4374G-A和4493C-A）改变导致该位点氨基酸（分别为C1156Y，L1196M）改变，同时进行细胞学试验和磷酸化检测验证了该突变确实可导致耐药的出现。ALK与ATP或ALK抑制剂的结合程度与两处突变在ALK基因蛋白空间构象上所处的位置有着重要的关系[17]。除了ALK激酶域的突变外，耐药性的几个机制还可能解释为ALK基因重排的拷贝增加或者是EGFR/KRAS基因突变等。

临床病理特点：最近研究显示，EML4-ALK融合基因存在于大约3%~7%的非小细胞肺癌患者。临床特点为倾向于腺癌（特别是实性、印戒细胞和黏液筛状型）、不吸烟或轻度吸烟，年轻人的患者。但此基因的融合也见于老年有吸烟史的患者[18]。

有关非小细胞肺癌ALK融合基因检测的研究陆续见到报道，发生率约为5%（0.5%~7.5%）。不同实验室结果也略为不同。来自我国第一份研究显示，在肺腺癌该融合基因的检出率为16.13%，而非吸烟患者略高，为19.23%。而EGFR、K-RAS、HER2基因未发生突变的NSCLC中，ALK融合基因阳性检出率可高达25%[19]。在我国大陆及台湾地区K-RAS及EGFR均为野生型的腺癌中ALK检出比例可高达42.8%。组织学为实性、印戒细胞和黏液筛状型腺癌中ALK的发生率远远高于其他类型腺癌（分别为46.2%，8%）。

因此有些学者建议在具有ALK病理学特征的，并且已经明确EGFR和K-RAS分子检测为野生型的非小细胞肺癌患者中开展ALK检测会大大提高检测的阳性比率，此举利于临床工作的开展。但实际研究发现在一些非腺癌患者中，如腺鳞癌、鳞癌以及EGFR和K-RAS突变型的肺癌中也可以检测出ALK阳性[20]。对于富集人群开展常规ALK的分子检测是必需的。但仅凭这些临床病理学特点远远不能完全反映全部情况，所以广泛开展ALK筛查是非常必要的。

3 检测方法学

对非小细胞肺癌患者肿瘤组织内ALK融合基因进行检测， 目前有3种不同的方法分别为：FISH法（fluorescence in situ hybridization，FISH），基于PCR法（包括RACE-PCR，qRT-PCR或特异性RT-PCR）及免疫组织化学方法。由于肿瘤患者的组织来源类型不同，有时需要以标本类型选择不同的方法进行检测，而上述三种方法检测原理以及各自存在不同的优缺点，所以当怀疑一种技术的可靠性时，可以考虑用另外一种方法进行验证。下面就对这三种方法进行一一介绍。

FISH检测：此方法为最早被FDA认证的克唑替尼（Crizotinib）处方使用推荐的检测方法，推荐使用雅培公司Vysis ALK断裂部分FISH探针试剂盒（Abbott Molecular，Inc）来进行非小细胞肺癌患者肿瘤组织中ALK融合基因检测[21]。大部分克唑替尼治疗的ALK融合基因阳性的非小细胞肺癌的临床实验均是依据FISH检测的结果。因此，FISH检测仍是ALK基因检测的参照标准方法。此方法学的显色原理：由于ALK和EML分别位于2号染色体的3'和5'两端位置，分别在300kb3'端和442kb的5'端用标记的两个探针（分别为橘红色和绿色）进行标记。当未发生倒位时二者都应位于ALK基因侧，因此红色与绿色信号彼此紧邻。当EML4-ALK融合基因存在时，由于具有ALK激酶区域的EML的N'末端发生倒位，产生了包含酪氨酸激酶（TK）活性的癌蛋白嵌合体。这个结果导致了橘红色和绿色探针的距离拉远。

为保证检出的可靠性，组织的前期处理尤为重要。FISH检测法肿瘤组织前期处理的具体要求：活检或者切除标本需要用10%中性福尔马林固定充分，一般固定时间要求为6~24h。包埋组织块的大小要求不超过2cm宽，3mm厚。处理过程要求符合标准。最好切成3~5μm厚度的切片，用涂胶片可以避免裂缝假象及避免洗掉。需要在60℃微波炉内烤片1h，或在45℃保温箱内过夜。石蜡组织块最好为1~6个月之内的，这样RNA降解较少，可以很好地避免杂交失败，以避免假阴性和假阳性结果的出现。标本的适度脱蜡是避免组织切片染色出现背景或不均匀等问题的关键。组织消化时间多少需要在在工作中进行实际调整。当细胞成分少于50%的细胞学标本，对肿瘤细胞的进行显微切割是非常必要的。最少的肿瘤细胞数在组织学标本中不少于100个细胞，大于一半不能为荧光染色，由于立体分析的原因。少于40个的肿瘤细胞标本阳性的FISH信号是不可信的。

阳性结果的判读标准： 至少红色与绿色信号之间存在一定距离，应大于等于大的信号直径的2倍。单独出现红色信号时，而无绿色信号伴随出现，提示基因由于转化或缺失导致的融合。当单一的绿色信号出现，而无红色信号伴随时被认为阴性。同样，非重排的ALK基因增加的拷贝数融合信号代表染色体的多倍体或ALK扩增，而非重排。当大于25个细胞（50%）是认为阳性。小于5个细胞是阴性（10%）；当5~25个细胞阳性（0~50%）被认为是模棱两可的！应该重做一遍。如果重复后两次的平均值在至少15%的阳性细胞，此时被认为阳性。

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虽然，原位杂交技术是首先被FDA推荐的一种检测ALK融合基因技术。但它也存在许多不足之处。首先，该检测试剂盒的价格昂贵，不利于广泛推广采用，同时这种方法不能明确ALK融合基因的具体变异体。另外，对于操作和判读的要求较高，必须进行严格培训的诊断医生才能胜任。其次，多数的患者发现肿瘤时为晚期肺癌，此时已经失去手术机会，只能获取很小的活检组织，小活检组织很难保证每个视野具有足够的肿瘤细胞进行判断。所以，此方法严重的限制了对大多数非小细胞肺癌患者的大规模的筛查及诊断。

免疫组化法 FISH检测法为FDA认证的克唑替尼处方使用推荐的检测方法。此技术最初被认为ALK融合基因检测的金标准。但由于FISH检测技术操作难度大，普及较为困难，以及其价格昂贵，此方法的用于ALK筛查面临较大的阻力。因此探索其他分子诊断检测方法成为必然。免疫组织化学法为病理医生熟悉，其操作简便易行，价格便宜等优点，成为潜在的筛查方法。通过大样本和不同抗体成功的证实免疫组化法也变成较好的筛查方法。免疫组化检测的生物前提是ALK基因异位和转化具有多个可能存在的配体导致ALK蛋白的过表达。ALK蛋白酪氨酸激酶是克唑替尼的靶点。 因此，可以直接合理评价药物。

目前，ALK免疫组化检测法可以分为手动免疫组化法和由罗氏公司开发的Ventana全自动仪器操控两种方法。免疫组化检测法作为一种半定量实验方法，有经济、迅速、容易得出诊断性的实验结果的优点，并为病理学专家熟悉。虽然使用IHC法仅仅是处于初筛状态（尤其是手动免疫组化染色）。这种方法需要面临如下问题：组织的前期处理、抗体的选择、显色信号放大系统以及评分系统等。

组织前期处理阶段：包括组织的固定、固定所持续时间可能对于ALK抗原的保存情况均没有被评价。假阴性可能由于固定较差而出现。在外科手术切除标本，阳性梯度的出现可能由于组织固定穿透性的梯度导致的。

抗体的选择：目前针对ALK融合蛋白检测常见的有三种抗体，即ALK1，D5F3和5A4。大量的实验研究证明，由于非小细胞肺癌组织内ALK融合蛋白浓度相对较低，最早出现的抗体ALK1敏感性较差，仅适合用作识别间变性淋巴瘤，不适合用于非小细胞肺癌ALK融合基因的检测。随着不断的探索，新一代的具有较高敏感性的抗体陆续出现，如D5F3和5A4，有研究针对这两种抗体与FISH法进行对照研究，得出二者对非小细胞肺癌ALK融合基因检测的敏感性和特异性分别达到了100%及95%~99%[22]。

评分系统方面的问题主要见于手动免疫组化法，ALK免疫组化阳性部位是胞浆，呈棕黄色颗粒状改变，在一些例子同时可以表现为膜阳性。评价阳性的强度是非常主观的，并且缺乏统一的评价标准。改良H-score法是依次使用物镜用法评价阳性强度可以得出更统一的强度评分。通常认为在2倍或4倍物镜下可以清楚看到阳性为（3+）；而在10倍或20倍物镜下可以清楚看到阳性为（2+）；在40倍物镜下可以清楚看到阳性（1+）。

采用免疫组化法需注意以下的问题。由于ALK融合蛋白表达与神经外胚层的分化有关，故其可能在正常人的神经组织和小细胞肺癌中存在表达。因此，不推荐在小细胞肺癌中使用ALK融合蛋白的免疫组化检测。另外，在坏死组织、黏液组织以及肺泡腔内的泡沫细胞经免疫组化染色常易着色，造成假阳性结果，在判读免疫组化染色结果时一定要加以注意。

显色信号放大系统：罗氏的Ventana全自动仪，可以做到检测流程及判读结果都达到标准化。其特色的技术是使用了基于非内源性半抗原、信号扩增多聚体及辣根过氧化酶系统染色信号放大技术。不影响结果的特异性的前提下，大大提高了ALK融合蛋白检出的敏感性。

免疫组化结果与FISH检测的一致性：来自三个大样本的免疫组化与FISH法对照研究结果显示：FISH法阴性同时免疫组化法也总是阴性（一致性为100%），IHC3+阳性与FISH检测完全一致，两种方法存在较好的符合率[23]。因此，有的学者建议用IHC评价的病例无需再通过FISH检验。但是，另一些实验室有不同的结果，免疫组化判读为3+，而FISH检测为阴性；也有的病例FISH检测阳性，而免疫组化为阴性结果。因此，有学者建议所有经免疫组化法ALK阳性的病例都应该行FISH或PCR法进行验证。

RT-PCR 此方法是一种敏感性高，而且快速出结果的分子检测技术，即使存在较少的RNA拷贝数也可以检测出来。因此，RT-PCR法可以用于对FISH法和免疫组化法的结果进行检验。也可以代替FISH法和免疫组化法单独用于ALK融合基因的检测。此法可以用来检测出多个已知的ALK融合基因突变体的存在。然而其也存在一些不利因素，阻碍了其不能成为此种检测的标准检测方式。RT-PCR法需要高品质的RNA，需要超过1000bp的扩增子并且要恰当的低温保存肿瘤组织，这在常规工作中是很难达到的。常规工作中，多数肺癌标本都是石蜡包埋组织，长时间后组织内RNA的降解难以避免。另外，由于ALK融合基因已知存在20多种变异体的存在，需要多组引物才能完成，这种检测要求更复杂的系统来实现。基于RT- PCR 技术对实验室有较高要求，这也是其难以成为 ALK 检测主要方法之一。

对于ALK融合基因的检测，尽管常见于上述3种方法，但有不同的研究者仍在探讨一些改良方法或者创新的方法。韩国首尔国立大学评价了FISH和一种新的方法——显色原位杂交法（chromogenic in situ hybridization，CISH），用来评价两种方法在检测ALK基因重排的一致性的研究。该实验对465例NSCLC进行CISH法检测，18例检测出ALK基因重排，阳性率为4%。两种检测方法高度一致性（吻合系数为0.92）。另外，还对比了CISH与IHC检测ALK基因状态和ALK蛋白表达情况，也表现为较高一致性（吻合系数为0.82）[24]。

综上所述，ALK融合基因阳性的非小细胞肺癌是肺癌的新的分子亚型，也是继EGFR、 KRAS之后发现的又一个重要肿瘤靶点。其靶向治疗药——克唑替尼的出现为非小细胞肺癌患者带来新的希望。在临床工作中，要根据肺癌标本的类型合理的、 顺次的进行靶点基因的筛选，依据具体检测结果选择相应的个体化靶向治疗，最终达到提高肺癌患者的生存质量和延长生存时间的目的。

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（收稿日期：2014-02-11）

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