复方守宫散对Lewis肺癌小鼠JAK2-STAT3信号通路的影响

沈迪△  李崇慧▲  周晋华  徐海惠 周鹏飞

[摘要] 目的 观察复方守宫散对Lewis肺癌小鼠JAK2-STAT3信号通路的影响。 方法 将55只C57BL/6J小鼠按常规方法接种Lewis肺癌瘤株，6d后选取荷瘤成功的小鼠50只随机分为5组：阳性对照组、西药组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组，每组10只。阳性对照组：灌服生理盐水0.2mL，1次/d；中药组灌服复方守宫散高剂量组0.6mL（相当于120mg/kg），中剂量组0.4mL（相当于60mg/kg），低剂量组0.2mL，（相当于40g/kg），1次/d；顺铂组按1mg/kg给药，0.1mL/只腹腔注射。每天1次，共14d。在光镜下用HE染色法观察肿瘤组织病理形态学改变情况，用Western Blot法检测JAK2、STAT3蛋白的表达水平。 结果 各给药组JAK2、STAT3蛋白的表达水平出现不同程度降低，且JAK2降低较为明显。 结论 复方守宫散能够抑制肿瘤生长，降低 Lewis瘤细胞中JAK2、STAT3蛋白的表达，并通过此方式阻断JAK2-STAT3信号转导 。

[关键词] 肺癌；信号通路；实验研究

[中图分类号] R734.2   [文献标识码] A   [文章编号] 2095-0616（2014）09-17-05

Study on the effects of Compound Shougong Powder on the JAK2-STAT signaling pathway of mice with Lewis lung carcinoma

SHEN Di1  LI Chonghui2  ZHOU Jinhua2  XU Haihui1  ZHOU Pengfei1

1.Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230000, China; 2.Department of Oncology, First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230000, China

[Abstract] Objective To observe the effects of Compound Shougong Powder on the JACK2-STAT3 signaling pathway of mice with Lewis lung carcinoma. Methods 55 C57BL/6J mice were inoculated with tumor cell lines of Lewis lung carcinoma via a conventional method. 50 tumor-bearing mice were selected after six days and assigned to five groups: a positive control group, a western medicine group, a TCM group with high dosages, a TCM group with medium dosages, and a TCM group with low dosages, with 10 mice in each group. The positive control group was orally given normal saline of 0.2 mL once a day; the TCM groups were orally given compound shougong powder of 0.6mL for the group with high dosages (equal to 120 mg/kg), 0.4mL for the group of medium dosages (equal to 60mg/kg), and 0.2 mL for the group with low dosages (equal to 40 mg/kg) once a day; the Western medicine group was intraperitoneally injected with cisplatin of 1 mg/kg, 0.1mL each, once a day for 14 days. Pathological and morphological changes of tumor tissues were observed via HE staining under light microscope, and expression levels of JAK2 and STAT3 proteins were tested via the Western Blot. Results Expression levels of JAK2 and STAT3 proteins in each group decreased with different degrees, and the decrease of JAK2 was relatively significant. Conclusion Compound Shougong Powder inhibits tumor growth, lowers the expression of JAK2 and STAT3 proteins in Lewis tumor cells, and in such way blocks the JACK2-STAT3 signaling pathway.

[Key words] Lung carcinoma; Signaling pathway; Experimental study

肺癌是对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）所占比例高达85％。化疗在中晚期非小细胞肺癌的治疗中发挥着重要作用，但且化疗药物毒副作用较大，使许多中晚期非小细胞肺癌患者难以坚持完成化疗。在

我国，现代医学结合中医药治疗肺癌是一大特色，临床应用有效，本实验将Lewis廇小鼠作为研究体系，观察了中药与西药作用后癌基因STAT3信号通路相关蛋白JAK2 、STAT3 的表达，为中医药的临床运用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞

C57BL/6J小鼠50只，体重（20±2） g，雄性，由安徽医科大学二附院动物房提供（动物许可证号：晥20130017 ） 。小鼠Lewis肺癌细胞（ Lewis lung cancer cell line，LLC）， 中国科学院上海生命科学研究院细胞库提供。

1.2 模型建立

细胞培养：复苏小鼠Lewis肺癌细胞，贴壁生长于DMEM培养液中（含10%灭活胎牛血清及100U/mL青霉素、链霉素），置37℃、5%CO2培养箱中。约3d传一代，用0.25%胰酶消化。正常传3代后，胰蛋白酶消化法制成细胞悬液，台盼蓝染色计数活细胞率＞95%，用PBS液调整活细胞浓度为2×107/mL，取0.2mL瘤细胞悬液接种于每只C57BL/6J小鼠右侧前肢腋下皮下。国家标准固体混合饲料喂养。接种6d后，以小鼠右侧前肢腋下皮下可触及米粒大小肿瘤块，标志造模成功。

endprint

1.3 分组与给药

随机分为阳性对照组、高剂量复方守宫散组、中剂量守宫散组、低剂量守宫散组、顺铂组，每组10只。实验第2天（造模成功24h后），阳性对照组：灌服生理盐水0.2mL，1次/d；中药组灌服复方守宫散高剂量组0.6mL（相当于120mg/kg），中剂量组0.4mL（相当于60mg/kg），低剂量组0.2mL（相当于40g/kg），1次/d；顺铂组按1mg/kg给药，0.1mL/只腹腔注射。每天1次，共14d。

1.4 药品与试剂

（l）复方守宫散（安徽省中医院中药房）。（2）顺铂（江苏豪森药业股份有限公司，国药准字H200408l3，产品批号070902）。（3）①电化学发光（ECL）试剂盒：美国pierce公司 ；②actin（购自北京中山公司）；③DMEM培养基（美国Gibco公司生产）；④ 山羊抗兔二抗 、JAK2、STAT3（北京博奥森生物技术有限公司）；⑤10%胎牛血清（杭州四季青生物制品有限公司）。

1.5 实验器材

水浴恒温振荡器，湘仪高速离心机，生物安全柜，光学显微镜，包埋机，手动石蜡切片机，摊片机，烘片机，智能化组织脱水机，电子天平，高速冷冻离心机，电泳仪，凝胶自动成像及分析系统等。

1.6 观察指标

1.6.1 肿瘤抑制率 停药后第2日处死动物，完整剥取肿瘤，称重量，计算肿瘤抑制率。抑瘤率=（对照组平均瘤重-实验组平均瘤重）/对照组瘤重×100%。

1.6.2 瘤组织JAK2、STAT3蛋白测定 采用Western blot 法。剪取肿瘤组织，称重，每个样品重量在100mg左右，加入RIPA细胞裂解液1mL（内含1mM PMSF）进行裂解。离心，收集上清液，即含有组织总蛋白。在收集的蛋白样品中加入等量的2X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。沸水浴加热10min，以充分变性蛋白。待样品冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内。每孔加15μL。浓缩胶所用电压为80V，时间为30min；分离胶所用电压为120V，时间为1h。将预先裁好与胶条同样大小的滤纸和PVDF膜（预先在甲醇中浸泡3min），浸入转膜缓冲液中5min。接通电源，恒流转膜。5%BSA在摇床上缓慢摇动，室温封闭2h。分别用一抗：抗beta-actin抗体，抗体属性为鼠抗；1︰1000稀释，10%的分离胶；抗Jak2、Stat3抗体属性为兔抗；1︰1000稀释，10%的分离胶抗。4℃缓慢摇动孵育过夜。加入洗涤液（TBST），每次洗涤10min，共洗涤3次。HRP标记的相应二抗1︰10000稀释液稀释，室温封闭2h。加入洗涤液（TBST），每次洗涤10min，共洗涤3次。用ECL发光试剂盒说明来检测蛋白。

1.7 统计学方法

用SPSS17.0统计软件分析，计量资料采用（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用取LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤组织病理切片结果

（1）目检：肉眼观移植瘤有完整包膜，易分离，肿瘤组织血供丰富，无明显周围组织和皮肤浸润，切面呈鱼肉样；（2）镜检：模型组：肿瘤细胞呈巢状，弥漫大片状分布，肿瘤细胞排列不规则，体积大，核大深染，异型性明显，核分裂相较治疗组多见，间质血管丰富，肿瘤组织中可见小灶性坏死，可见血管内瘤栓形成，侵犯周围肌肉及脂肪组织。其余治疗各组：DDP组肿瘤组织呈巢状、弥漫小片状分布，凝固性坏死面积较大，肿瘤细胞核固缩较中药组肿瘤组织明显，肿瘤细胞核分裂相减少，见大量核碎裂，血窦丰富，可见腺样良索状分布，中药各组均可见弥漫大片状分布肿瘤细胞，可见小灶性坏死，可见大量深染细胞核，巨核细胞、多核细胞。见图1~5。

图1  灌服生理盐水阳性对照组（HE×400）

图2

图3

图4

图5

注：HE×400，图1表示灌服生理盐水阳性对照组，图2表示灌服西药顺铂组，图3表示灌服中药复方守宫散高剂量组，图4表示灌服中药复方守宫散中剂量组，图5表示灌服中药复方守宫散低剂量组

2.2 对小鼠肿瘤的影响

实验结束前称小鼠体重，脱臼处死小鼠后，迅速剥离瘤体，称重，计算抑瘤率。结果表明：各实验组对瘤重均具有一定的抑制作用，与阳性对照组比较瘤重明显减轻，差异具有统计学意义（P＜0.05）。西药组与中剂量、低剂量中药组比较，西药组瘤重较轻，差异有统计学意义（P＜0.05）。中药各组间比较，随着中药剂量的提高，抑瘤率逐渐提高，且差异有统计学意义（P＜0.05）。以上结果说明复方守宫散对肺癌小鼠有抑瘤作用，5组间两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。数据见表1。

表1  各组瘤重及抑瘤率比较（）

组别 n

（起始总数/存活数） 平均瘤重

（g） 抑瘤率

（%）

阳性对照组 10/7 2.91±0.24 -

DDP组 10/8 1.29±0.07* 55

中药高剂量组 10/8 1.42±0.06*# 51

中药中剂量组 10/8 1.58±0.06*#▲ 46

中药低剂量组 10/8 1.82±0.05*#▲△ 37

注：每组抑瘤率（%）=（对照组瘤重 - 实验组瘤重）/ 对照组瘤重×100%。与对照组比较， *P＜0.05，与DDP组比较，#P＜0.05；与中药高剂量比较，▲P＜0.05；与中药中剂量组比较，△P＜0.05

2.3 免疫印迹法检测各组JAK2 STAT3蛋白含量

JAK2、STAT3蛋白表达的免疫印迹试验检测结果显示：阳性对照组蛋白条带颜色较明显，JAK2、STAT3表达水平较高；DDP组蛋白条带颜色与中药各组相比颜色较浅，JAK2、STAT3表达水平较低；中药各组随着剂量的增加蛋白条带颜色变浅，JAK2、STAT3表达水平逐渐降低。各组蛋白平均灰度值见表2，蛋白表达见图6。

3 讨论

复方守宫散是我科多年临床经验成方药，主要由人参、何首乌、三七、守宫、绿萼梅组成，临床观察可以缓解改善晚期肺癌的生活质量，缓解疼痛，亦

表2  JAK2、STAT3蛋白的平均灰度值（）

组别 JAK2 STAT3

阳性对照组 1.15994465±0.078114445 1.601687904±0.001737841

DDP组 0.22111620±0.052118456 0.843041454±0.02331237

中药高剂量组 0.33721824±0.056273485* 1.057710655±0.027987233

中药中剂量组 0.60361609±0.047016882* 1.140041643±0.027435129

中药低剂量组 0.96174943±0.056689694** 1.347452717±0.040262261

注：与阳性对照组比较，*P＜0.05；与阳性对照组比较，**P＞0.05

DDP高 中低 阳

Actin

JAK2

STAT3

图6  顺铂组，中药高、中、低剂量组的JAK2，STAT3蛋白表达量与标准Actin蛋白表达的比较

endprint

能降低化疗毒副反应作用。现在药理研究表明灌服鲜壁虎冻干粉的小鼠含药血清对 C6胶质瘤细胞有诱导凋亡的作用，认为其机制可能与上调 bax基因有关[1]。守宫中分离得到的硫酸守宫多糖与人肝癌细胞BEL-7402共同培养，发现肝癌细胞由多边形变为纺锤形，并且肝癌细胞甲胎蛋白分泌量减少，而转氨酶分泌量增多，同时经流式细胞学检测癌细胞被阻滞于G2，M期，因此认为硫酸守宫多糖可诱导人肝癌细胞分化[2]。人参中的有效成分人参皂苷具有多种药理作用，调节肿瘤细胞信号通路系统、降低肿瘤细胞端粒酶活性增强机体免疫力提高抗肿瘤能力以及阻断肿瘤细胞某些重要成分的合成与代谢等[3]；三七含有天然多糖物质，对肿瘤细胞有抑制作用[4]，三七活性成分Rh2、Rg3在抑制肿瘤细生长的同时，能够保护荷瘤小鼠的免疫器官并增强免疫功能，提高免疫小鼠的免疫应答，调节细胞因子的分泌，从多方面发挥抗肿瘤作用[5]；何首乌中大黄素具有抑菌、抗炎、保护肝肾功能、改善微循环、抗肿瘤等作用[6]。

JAK2/STAT3信号通路在多种肿瘤组织和细胞系中持续激活和异常表达，能够促进肿瘤的增殖、侵袭、血管生成和转移[7]。已有多项研究结果证实JAK2/STAT3信号通路在多种肿瘤中过度活化，如胃癌、肝癌等，并且该通路与肿瘤组织中的MVD值密切相关[8-9]。

STAT3是JAKs的直接底物，能将信号直接传递到核内，调节特定基因的表达，目前研究最多的是STAT3和STAT5，STAT3和肿瘤的形成与发展密切相关。信号转导与转录激活因子3（Signal transduction and activators of transcription，STAT3）蛋白大约由770个氨基酸组成，有三种异构体：STAT3α（即一般意义所指的STAT3）、STAT3β和STAT3γ。参与细胞生长、发育、分裂及分 化等多种正常生理过程[10]。JAK/STAT信号通路是继Ras途径之后又一重要的细胞因子信号传导通路，在调节细胞增殖、分化、凋亡以及免疫调节、炎症、肿瘤等多种病理生理过程中发挥重要作用。JAK/STAT信号传导通路异常活化可导致细胞异常增殖和恶性转化。STAT3在多种肿瘤组织与细胞系中都有异常表达或活性增强 [11]，它的下游靶基因很多都与细胞增殖、凋亡密切相关，如Bcl-xl、Bcl-2、Mcl-1以及细胞周期素、Fas和血管内皮生长因子[12-13]等。而STAT3自身又受到细胞内多种信号转导途径的调控。同时发现STAT3在许多实体肿瘤和血液肿瘤中被激活，这可能与STAT3的促生长作用和抗凋亡作用有关[14]。所以STAT3的激活可能与肿瘤发生、发展的机制相关联。Niu等[15]发现阻断STAT3的信号转导，可使VEGF的表达下调，且STAT3蛋白可结合VEGF启动子，提示VEGF基因的表达是通过STAT3蛋白来调节。余祖滨等[16]以脂质体为载体将SOCS3基因转染至人肺腺癌细胞，发现转染后细胞中SOCS3稳定表达，STAT3蛋白酪氨酸磷酸化水平显著下降，提示SOCS3蛋白可能通过降低STAT3酪氨酸磷酸化水平，抑制NSCLC细胞的增殖。He等[17]发现，NSCLC细胞中SOCS-3基因启动子高度甲基化而失去转录活性，导致了STAT3基因表达的上调，提示通过高度甲基化阻断SOCS3转录，可能是激活癌变过程中的JAK-STAT3途径的一个重要机制。而使SOCS3恢复表达之后，能够导致STAT3表达下调，诱导癌细胞调亡和抑制肿瘤细胞生长。随后，在He等[18]的研究中也证实通过甲基化使SOCS3基因启动子沉默，可促进癌细胞凋亡，抑制其增殖。提示SOCS-3可能成为NSCLC治疗的一个新靶点。

本实验结果表明各给药组与阳性对照组比较肿瘤平均瘤重较低，中药、西药对肿瘤的生长均有一定的抑瘤作用，复方守宫散组与顺铂组比较抑瘤率相对较低，且与中药剂量呈正相关；Western blot检测结果显示中药、西药均可以降低JAK2、STAT3蛋白的表达，阻断JAK2-STAT3信号转导，西药组的表达量明显较中药组低，说明抗肿瘤作用可能是通过降低JAK2、STAT3蛋白的表达，阻断JAK-STAT3信号转导来实现。

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（收稿日期：2014-03-03）

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（收稿日期：2014-03-03）

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