江边一碗水炮制方法的优选

邓旭坤，蒋 捷，蔡 爽，陈旅翼， 林亲雄，梅之南，吴 非， 高康丽

(中南民族大学 药学院，武汉 430074)

江边一碗水是小檗科植物南方山荷叶(DiphylleiasinensisLi)的根茎，分布于湖北、甘肃、陕西、云南、四川等省，是土家族常用的民族药材，其根茎具有祛风湿、活血止痛、消瘀散肿、清热解毒和抗癌的功能[2]，常用于风湿腰腿疼痛、跌打损伤、痈肿疮疖、毒蛇咬伤等疾病的治疗[3].鬼臼毒素是江边一碗水的主要活性成分之一，具有明显的抗病毒、抗肿瘤活性[4]，用于治疗HPV引起的尖锐湿疣以及生殖器感染等疾病[5,6].江边一碗水的毒性较强，临床常有使用中毒的报道[9]，恰当的中药炮制可起到很好的减毒、增效、缓和药性，易于服用等作用[7].笔者通过查阅文献和实地调研发现[8]，土家医在临床使用前通常要对药材采用童便浸泡制、醋蒸制、醋炙制、姜汁制、醋磨制等炮制方法进行处理[8]，本文以高效液相色谱法检测江边一碗水生品和炮制品中鬼臼毒素的含量变化，比较了这5种炮制方法对其活性成分含量的影响，为土家药“江边一碗水”炮制工艺的优化和规范化提供了一定的科学依据.

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪(Ultimate 3000 型,美国戴安)，旋转蒸发仪(RE 52-98型, 上海亚荣生化仪器厂)，循环真空泵(SHZ-III型,上海亚荣生化仪器厂)，电热鼓风干燥箱(101-OAB 型,天津市泰斯特仪器有限公司)，超纯水机(ASWO-0005-M 型, 重庆颐洋企业发展有限公司)，电子天平(CP 214 型,奥豪斯仪器上海有限公司)，电磁炉(广东康宝电器有限公司).

1.2 试药

鬼臼毒素对照品(本实验室自制，由面积归一化测定其含量为94.5%)，江边一碗水 (产于湖北神农架林区，购于亳州市飒枫中药饮片有限公司，由中南民族大学万定荣教授鉴定为南方山荷叶DiphylleiasinensisLi.的根茎)，甲醇(色谱纯, 美国Tedia Company)，氯仿、甲醇(分析纯,天津博迪化工股份有限公司).

2 样品的制备

参考文献[8]，得出江边一碗水各炮制方法的较优条件[8].江边一碗水生品：除去杂质，润透后切薄片晾干.童便浸泡法：将25 g生品浸入约120 mL童便中1周后，取出晾干；醋蒸炮制品：将25 g生品切片、用30%米醋闷润1h后置于锅内蒸制2 h后，晒干备用；醋炙炮制品：将25 g生品切片，用30%米醋闷润2h后，在150 ℃下炒 4 min，晒干备用；姜汁炮制品：将适量生姜榨汁，取25 g生品切片，用120 mL姜汁浸泡至透，晒干备用；醋磨炮制品：取生品根茎25 g，与适量食醋共磨、研粉，晒干备用.

3 方法与结果

3.1 江边一碗水鬼臼毒素的含量测定

3.1.1 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18 色谱柱(4.6×250mm);流动相：甲醇-磷酸二氢钾水溶液(0.l moL/L, 45︰55); 柱温：30℃；流速：1mL/min；检测波长：290 nm；进样量：10 μL[10].色谱结果见图1.

3.1.2 对照品溶液的制备

精密称取在P2O5干燥器中减压干燥12 h的鬼臼毒素对照品适量，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成约5.0 mg/mL的溶液，作为鬼臼毒素储备液.再精密吸取储备液2 mL，加甲醇制成约1.0mg/mL的溶液，摇匀，微孔滤膜(0.45mm)过滤，即得对照品溶液[11].

3.1.3 供试品溶液的制备

取生品和各炮制品粉末(过3号筛)约0.2g，精密称定，加氯仿50 mL，置水浴中加热回流1 h，放冷，过滤，滤液挥干氯仿后，加甲醇溶解，过滤，滤液定容于50 mL量瓶中，微孔滤膜过滤，得6组供试品溶液[11].

a) 对照品; b) 生品; 1) 鬼臼毒素图1 鬼臼毒素与生品HPLC图Fig.1 The HPLC chromatograph of podophyllotoxin and Diphylleia sinesis

3.1.4 线性关系考察

精密吸取对照品储备液0.4，1，2，3，4 mL置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别进样10 μL，记录色谱峰面积.以对照品溶液的浓度X(mg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行回归处理，得线性方程为：Y=77.626X-0.0274(r=0.9998).说明鬼臼毒素在0.2～2 mg/mL范围内呈良好的线性关系.

3.1.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液10 μL，重复进样5次.测定峰面积，RSD=0.9933%.

3.1.6 稳定性试验

将同一供试品溶液，在上述色谱条件下于0, 3, 6, 9, 12 h 分别进样 10 μL，测定峰面积.结果鬼臼毒素的峰面积的RSD=1.693%,表明供试品溶液在12 h内稳定(n=5).

3.1.7 重现性试验

取同一药材粉末样品0.2 g，按照2.1.3项方法制得供试品溶液6份，在上述色谱条件下测定峰面积RSD=1.393%.

3.1.8 加样回收实验

称取已知含量的江边一碗水粉末6份，每份约0.2 g，精密称定，加入鬼臼毒素对照品适量，按3.1.3项制成供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，计算回收率，结果见表1.由表1可见，鬼臼毒素的平均价样回收率为99.0% (RSD=1.919%)，结果表明该方法测定结果准确可靠.

表1 鬼臼毒素加样回收率考察

3.2 样品测定

精密量取对照品溶液与供试品溶液各 10 μL进样，按上述色谱条件测得峰面积，通过标准曲线计算含量，结果见表2. 由表2可见，不同炮制品中鬼臼毒素的含量由大至小分别是：醋炙品>醋蒸品>醋磨制品>生品>童便浸泡制品>姜汁制品.

表2 5种炮制品中鬼臼毒素的含量

4 讨论

本实验选择甲醇-磷酸二氢钾水溶液(0.l moL/L)为流动相时，易造成色谱柱堵塞，柱压过高.但是用水溶液代替磷酸二氢钾会导致其分离效果不佳，本文每次进样采集后，先用水-甲醇溶液(9︰1)洗脱5 min，再用甲醇-磷酸二氢钾水溶液(0.l moL/L, 45︰55)平衡，以保证较佳的分离效果.

恩施被称为“硒都”，蕴藏着举世罕见的硒资源和各种土家药[12]，土家药“江边一碗水”的活性成分鬼臼毒素具有显著的抗肿瘤和抗病毒活性[13]，已被《湖北省中药材质量标准》列为定量控制的指标性成分[11].笔者通过5种不同炮制方法得到各炮制品，其中鬼臼毒素含量依次为：醋炙品>醋蒸制品>醋磨制品>生品>童便浸泡制品>姜汁制品，.故醋炙法可使江边一碗水炮制品药材中的鬼臼毒素的提取率显著提高.本研究结果为江边一碗水炮制工艺的规范化研究提供了一些的实验研究依据.

参 考 文 献

[1] 蒋雨玲,史君星,张友恩,等.“江边一碗水”对小鼠半数致死量(LD50)的测定[J].临床急诊杂志,2012,13(1):25-26,29.

[2] 韩腾飞,董 浩,程 亮,等.江边一碗水的药用研究概况[J].中成药,2012,34(6):1151-1154.

[3] 陈吉炎,于 萍,陈师西,等.江边一碗水的本草考证[J].中药材,2010,33(2):303-308.

[4] Canel C, Moraes R M, Dayan F E, et al. Molecules of interest ‘Podophyllotoxin’.[J].Phytochemistry,2000,54(2):115-120.

[5] Gordaliza M ,García P A , Miguel del Corral J M , et al. Podophyllotoxin: distribution, sources, applications and new cytotoxic derivatives[J].Toxicon,2004,44(4):441-459.

[6] Li M F, Li W, Yang D L, et al. Relationship between podophyllotoxin accumulation and soil nutrients and the influence of Fe2+and Mn2+on podophyllotoxin biosynthesis in Podophyllum hexandrum tissue culture[J].Plant Physiol Biochem,2013,71:96-102.

[7] 张永清,王 鹏,纪玉佳,等.中药药性影响因素研究——炮制的调控作用[J].山东中医药大学学报,2011,35(1):5-7.

[8] 田华咏.中国民族药炮制集成[M].北京:中医古籍出版社.2000:9,214.

[9] 徐 祥, 郦小平.八角莲的毒理学研究现状[J].亚太传统医药,2011,(7)8:158-160.

[10] 赵祖兴.江边一碗水的质量控制研究[D].武汉:湖北中医药大学,2010.

[11] 湖北省食品药品监督管理局.湖北省中药材质量标准[M].武汉: 湖北科学技术出版社,2007: 57-58.

[12] 邓旭坤,李 游,蔡 俭,等.紫外分光光度法测定竹节参中微量元素硒的含量[J].中南民族大学学报:自然科学版,2013,32(2):66-68.

[13] 王莉莉,周应军.抗癌物质鬼臼毒素及其衍生物研究进展[J].国外医药:植物药分册,2006,21(1):6-9.