总状毛霉生物转化孕酮的研究

周斌+胡秋芬+杨海英+杨新周+牛德云+沈广剑+来天超+杜刚

摘要：为筛选羟基化多样性的菌株，对总状毛霉（Mucor racemosus）生物转化孕酮进行研究。转化产物经HPLC分析，共分离到6个转化产物，通过NMR、MS及FTIR等手段对孕酮转化产物进行结构鉴定。其结构为11α-羟基孕酮（1）；15α-羟基孕酮（2）；11α， 15β-二羟基孕酮（3）；6β， 11α-二羟基孕酮（4）；7β，15β-二羟基孕酮（5）；1-脱氢11α-羟基孕酮（6）。研究结果表明，总状毛霉转化孕酮的衍生物具有丰富的多样性。

关键词：生物转化；总状毛霉（Mucor racemosus）；孕酮；结构鉴定

中图分类号：O621.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）03-0666-03

1952年Murray等[1]利用黑根霉转化孕酮得到11α-羟基孕酮， 并在甾体工业中大规模应用，由此微生物转化技术在甾体药物生产中的重要性被广泛认识。而甾体化合物的羟基化是微生物转化技术应用的主要方面。羟基化反应是甾体化合物生物转化反应中最重要的反应，由于甾体母核上4个环上有多个次甲基，用化学法进行羟基化很难区分，不能反应的区域选择性及对映体选择性，微生物能够专一地在甾体母核或侧链上引入一个或多个羟基，羟基化改变了甾体的极性，进而影响其毒性、细胞分泌及药物分布，从而产生不同的药效，并可应用于甾体药物工业生产[2]。甾体化合物的羟基化是微生物转化技术应用的主要内容，已有较多的文献报道[3-6]。

筛选优良菌株、发掘新的生物催化剂是发展我国甾体工业的重要课题。而寻找羟基化多样性丰富的菌株，可产生多种羟基化衍生物，在甾体药物研发中会起到事半功倍的作用。已有总状毛霉（Mucor racemosus）转化甾体化合物的报道[7-11]，但未见转化孕酮的研究。本研究以实验室保藏总状毛霉菌株对孕酮进行了生物转化研究，筛选转化甾体化合物的催化系统，将来可进一步用于转化其它的甾体药物及药物中间体，为该菌株在开发甾体药物中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

孕酮购自江苏省盐城信谊医药化工有限公司，经NMR及HPLC检测纯度超过98%。

1.2 微生物菌株

总状毛霉为实验室保藏菌株，分离自重楼根状茎。

1.3 粗提物制备

转化用发酵培养基含3 g/L NaNO3、1 g/L K2HPO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O、0.5 g/L KCl、0.01 g/L FeSO4·7H2O、30 g/L蔗糖、孕酮1.0 g/L（pH 6.5），孕酮加少量乙酸乙酯溶解，再加4 g/L吐温80混匀，加水形成乳浊液加入1 L培养基。250 mL 锥形瓶装入100 mL发酵液，共发酵10 L。于28 ℃，220 r/min振荡培养6 d。发酵液用乙酸乙酯萃取，菌丝体用甲醇浸泡超声提取，真空浓缩合并得到粗提物。

1.4 HPLC分析

取0.1 g粗提物，加入1 mL甲醇溶解，用0.25 μm滤膜过滤。色谱柱，Agilent ZORAX SB-C18柱（4.6 cm×150 mm，5 μm）；检测器，二级管阵列检测器；流动相，甲醇-水（60/40，V/V）；流速，1.0 mL/min；检测波长，244 nm；柱温，40 ℃；进样量，5 μL。通过峰面积积分对各转化产物产率进行计算。

1.5 孕酮转化产物的分离纯化

正相硅胶（200-300目）∶样品=8∶1（V/V）装柱上样，以石油醚-乙酸乙酯体积比为9∶1-1∶9逐级梯度洗脱，含转化产物组分用半制备型高效液相色谱制备，色谱条件，甲醇∶水=50∶50（V/V），流速为3 mL/min，检测波长为244 nm，柱温为40 ℃。

2 结果与分析

2.1 转化结果HPLC分析

由图1可看出，孕酮基本被转化，转化产物极性较大，且种类很丰富。

2.2 孕酮转化产物分离及结构鉴定

经半制备分别得到6个组分：S1、S2、S3、S4、S5、S6。经核磁共振、紫外、旋光、熔点检测，结构鉴定分别为：11α-羟基孕酮（1）； 15α-羟基孕酮（2）；11α，15β-二羟基孕酮（3）；6β，11α-二羟基孕酮（4）；7β，15β-二羟基孕酮（5）；1-脱氢11α-羟基孕酮（6）。

化合物的理化鉴定结果如下：

（1） 11α-羟基-4-孕甾烯-3， 20-二酮 收率为7.2%；熔点： 165～169 ℃； 1H NMR δ： 5.73 （s， 1H， H-4）， 4.03 （td， 1H， H-11）， 2.55 （m， 1H， H-17）， 0.69 （s， 3H， H-18）， 1.31 （s， 3H， H-19）， 2.13 （s， 3H， H-21）； 13C NMR δ： 37.65 （C-1）， 34.30 （C-2）， 200.31 （C-3）， 124.72 （C-4）， 170.95 （C-5）， 33.70 （C-6）， 31.64 （C-7）， 35.07 （C-8）， 55.47 （C-9）， 40.05 （C-10）， 69.02 （C-11）， 50.58 （C-12）， 44.26 （C-13）， 55.47 （C-14）， 24.36 （C-15）， 23.07 （C-16）， 63.24（C-17），14.62 （C-18）， 18.42 （C-19）， 208.93 （C-20），31.49 （C-21）； MS m/z：353[M+ Na]+。与文献[12]对照一致。

（2）15α-羟基-4-孕甾烯-3， 20-二酮 收率为9.8%；熔点： 229～233 ℃； 1H NMR δ： 5.74 （s， 1H， H-4）， 4.10 （td， 1H， H-15）， 2.81 （s， 1H， H-17）， 0.69 （s， 3H， H-18）， 1.20 （s， 3H， H-19）， 2.13 （ s， 3H， H-21）； 13C NMR δ： 35.86 （C-1）， 34.07 （C-2）， 199.57 （C-3）， 124.01 （C-4）， 170.81 （C-5）， 32.84 （C-6）， 31.10 （C-7）， 35.32 （C-8）， 53.82 （C-9）， 38.71 （C-10）， 21.00 （C-11）， 38.99 （C-12）， 44.68 （C-13）， 61.00 （C-14）， 73.50 （C-15）， 35.44（C-16）， 62.92 （C-17）， 14.76 （C-18）， 17.60 （C-19）， 208.45 （C-20），31.71（C-21）； MS m/z： 353 [M+Na]+。与文献[13]对照一致。

（3）11α，15β-二羟基-4-孕甾烯-3， 20-二酮 收率为5.7%；熔点： 230～240 ℃； 1H NMR δ： 5.75 （s， 1H， H-4）， 4.05 （m， 1H， H-11）， 4.32 （m， 1H， H-15）， 2.51 （t， 1H， H-17）， 0.97 （s， 3H， H-18）， 1.35（s， 3H， H-19）， 2.15 （s， 3H， H-21）； 13C NMR δ： 35.92 （C-1）， 34.04 （C-2）， 201.64 （C-3）， 124.15 （C-4）， 173.01 （C-5）， 33.64 （C-6）， 30.62 （C-7）， 31.24 （C-8）， 58.82 （C-9）， 40.20 （C-10）， 68.04 （C-11）， 51.25 （C-12）， 43.82 （C-13）， 59.37 （C-14）， 69.39 （C-15）， 37.25 （C-16）， 63.40 （C-17）， 16.90 （C-18）， 18.08 （C-19）， 209.45 （C-20）， 31.28 （C-21）； MS m/z： 369 [M+Na]+。与文献[13]对照一致。

（4） 6β，11α-二羟基-4 -孕甾烯-3， 20-二酮 收率为32.8%；熔点： 245～248 ℃； 1H NMR δ： 5.78 （s， 1H， H-4 ）， 2.68 （t， 1H， H-17）， 0.73 （s， 3H， H-18）， 1.49 （s， 3H， H-19）， 2.14 （s， 3H， H-21）， 4.34 （m， 1H， H-6）， 4.09 （m， 1H， H-11）； 13C NMR δ： 37.46 （C-1）， 34.12（C-2）， 202.76 （C-3）， 126.00 （C-4）， 170.55 （C-5）， 72.08 （C-6）， 38.61 （C-7）， 28.22 （C-8）， 58.36 （C-9）， 39.15（C-10）， 68.03 （C-11）， 49.43 （C-12）， 44.12 （C-13）， 55.11 （C-14）， 23.98 （C-15）， 22.73（C-16）， 63.07 （C-17）， 14.06 （C-18）， 19.51 （C-19）， 210.63 （C-20）， 30.97 （C-21）； MS m/z： 369 [M+ Na]+。与文献[14]对照一致。

（5）7β，15β-二羟基-4-孕甾烯-3， 20-二酮 收率为43.4%；熔点： 243～250 ℃； 1H NMR δ： 0.96 （s， 3H， H-18）， 1.24 （s， 3H， H-19）， 2.15 （s， 3H， H-21）， 3.63 （m， 1H， H-7）， 4.46 （m， 1H， H-15）， 5.76 （s， 1H， H-4）； 13C NMR δ： 35.56 （C-1）， 33.81 （C-2）， 200.42 （C-3）， 124.48 （C-4）， 168.63 （C-5）， 42.32 （C-6）， 71.12 （C-7）， 38.68 （C-8）， 50.90 （C-9）， 38.06 （C-10）， 20.93 （C-11），39.51 （C-12）， 43.90 （C-13）， 60.24 （C-14），73.34 （C-15）， 33.48 （C-16）， 63.39 （C-17），15.41 （C-18）， 17.24 （C-19）， 209.52 （C-20），31.41 （C-21）； MS m/z： 369 [M+ Na]+。与文献[15]对照一致。

（6）11α-羟基-1， 4-孕甾二烯-3， 20-二酮 收率为1.2%；熔点： 225～230 ℃； 1H NMR δ： 6.09 （s， 1H， H-4）， 7.77 （d， 1H， H-1）， 6.16 （dd， 1H， H-2）， 2.52 （m， 1H， H-17）， 0.70 （s ， 3H， H-18）， 1.30 （s， 3H， H-19）， 2.12 （s， 3H， H-21）， 4.04 （m， 1H， H-11）； 13C NMR δ： 158.89 （C-1）， 125.31 （C-2），186.95 （C-3）， 124.74 （C-4）， 168.05 （C-5），33.16 （C-6）， 33.50 （C-7）， 34.40 （C-8），60.43 （C-9）， 44.06 （C-10）， 68.06 （C-11），49.93 （C-12）， 44.09 （C-13）， 54.96 （C-14），23.15 （C-15）， 24.48 （C-16）， 62.92 （C-17），14.51 （C-18）， 18.74 （C-19）， 208.86 （C-20），31.47 （C-21）；MS m/z： 351[M+Na]+。与文献[16]对照一致。

2.3 转化途径推测

根据化合物出现顺序及结构特点，对其结构推测如图2。首先，孕酮C-11、C-15羟基化分别转化成11α-羟基孕酮、15α-羟基孕酮，然后11α-羟基孕酮又同时进行两个方向转化：一个方向是转化成11α，15β-二羟基孕酮和6β，11α-二羟基孕酮；另一个方向是通过C-1、C-2脱氢酶的作用转化成1-脱氢11α-羟基孕酮。此外，7β，15β-二羟基孕酮转化率相对较高，而且转化产物中没发现7β-羟基孕酮和15β-羟基孕酮的衍生物，因此可以推测孕酮是直接转化成7β，15β-二羟基孕酮。

3 小结与讨论

总状毛霉转化孕酮得到6个转化产物，分别在C-6、C-7、C-11、C-15实现羟基化，表明孕酮具有多个位点可以通过生物修饰。通过本研究转化产物7β，15β-二羟基孕酮、15α-羟基孕酮与7α，15β-二羟基孕酮、15β-羟基孕酮相比较，可以说明同一底物在不同微生物的转化条件下，能在同一位点进行对映体选择，产生不同构效的化合物，由于化合物的构效不同，其对机体可能会产生不同的药物特性[17]，这需要人们更多的发现。孕酮具有多个可以生物修饰位点，而且同一位点能进行对映体选择，由此孕酮可以转化成多样性丰富的衍生物。

转化产物6还发生了1位的脱氢，表现出菌株转化多样性。说明总状毛霉不但有羟化酶存在，而且还有脱氢酶的存在，羟基化酶和脱氢酶属于细胞色素P450酶系[18]，这也说明细胞色素P450酶系的多样性，为其在其他甾体药物及药物中间体转化中的应用提供了依据。

参考文献：

[1] MURRAY H C， PETERSON D H. Oxygenation of steroids by mucorales fungi [P]. U. S.： Patant 2602769，1952.1952-07-08.

[2] 张丽清.微生物转化在甾体药物合成中的应用[J].医药工业，1985，16（1）：37-41.

[3] MAHATO S B， GARAI S. Advances in Microbial Steroid Biotransformation[J]. Steroids， 1997，62（4）：332-345.

[4] KIRK D N， TOMS H C， DOUGLAS C， et al. A survey of the high-field 1H-NMR spectra of the steroid hormones， their hydroxylated derivatives， and related compounds[J]. Journal of the Chemical Society-Perkin Transactions， 1990（9）：1567-1594.

[5] FERNANDES P， CRUZ A， ANGELOVA B， et al. Microbial conversion of steroid compounds： recent developments [J]. Enzyme and Microbial Technology，2003，32（6）：688-705.

[6] TONG W Y， DONG X. Microbial biotransformation： Recent developments on steroid drugs[J]. Recent patents on biotechnology，2009，3（2）：141-153.

[7] TORSHABI M， BADIEE M， FARAMARZI M A， et al. Biotransformation of methyltestosterone by the filamentous fungus mucor racemosus[J]. Chemistry of Natural Compounds，2011， 47（1）：59-63.

[8] FARAMARZI M A， ZOLFAGHARY N， YAZDI M T， et al. Microbial conversion of androst-1，4-dien-3，17-dione by mucor racemosus to hydroxysteroid-1，4-dien-3-one derivatives[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2009，84（7）：1021-1025.

[9] GE W， WANG S， SHAN L， et al. Transformation of 3 beta-hydroxy-5-en-steroids by mucor racemosus[J]. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic，2008，55（1-2）：37-42.

[10] GE W Z， LI N， SHAN L H， et al. Microbial transformation of 4-ene-3-one steroids by mucor racemosus [J]. Acta Microbiologica Sinica，2007，47（3）：540-543.

[11] FARAMARZI M A， BADIEE M， YAZDI M T， et al. Formation of hydroxysteroid derivatives from androst-4-en-3，17-dione by the filamentous fungus mucor racemosus[J]. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic， 2008， 50（1）：7-12.

[12] BLUNT J W， STOTHERS J B. C-13 NMR-studies .69. C-13 NMR-spectra of steroids-survey and commentary [J]. Organic Magnetic Resonance， 1977， 9（8）：439-464.

[13] BRYAN M B， SCOTT A P， CERNY I， et al. 15 alpha-hydroxyprogesterone in male sea lampreys，petromyzon marinus L[J]. Steroids，2004，69（7）：473-481.

[14] CHOUDHARY M I， BATOOL I， SHAH S A， et al. Microbial hydroxylation of pregnenolone derivatives[J]. Chem Pharm Bull（Tokyo），2005，53（11）：1455-1459.

[15] FARAMARZI M A， TABATBAEI Y M， AMINI M， et al. Microbial hydroxylation of progesterone with acremonium strictum[J]. FEMS Microbiol Lett，2003，222（2）：183-186.

[16] CHOUDHARY M I， MUHAMMAD N， SHAMSUN N K， et al. Microbial hydroxylation of hydroxyprogesterones and α-glucosidase inhibition activity of their metabolites[J]. Z. Naturforsch，2007（62b）：593-599.

[17] 王明媚.手性药物的制备方法[J]. 医药导报，2006，25（4）：325-327.

[18] 杜娟娟，陈红莉，李援朝. 甾体类细胞色素 P450 17α酶抑制剂的研究进展[J]. 药学学报，2013，48（1）：25-31.

转化产物6还发生了1位的脱氢，表现出菌株转化多样性。说明总状毛霉不但有羟化酶存在，而且还有脱氢酶的存在，羟基化酶和脱氢酶属于细胞色素P450酶系[18]，这也说明细胞色素P450酶系的多样性，为其在其他甾体药物及药物中间体转化中的应用提供了依据。

参考文献：

[1] MURRAY H C， PETERSON D H. Oxygenation of steroids by mucorales fungi [P]. U. S.： Patant 2602769，1952.1952-07-08.

[2] 张丽清.微生物转化在甾体药物合成中的应用[J].医药工业，1985，16（1）：37-41.

[3] MAHATO S B， GARAI S. Advances in Microbial Steroid Biotransformation[J]. Steroids， 1997，62（4）：332-345.

[4] KIRK D N， TOMS H C， DOUGLAS C， et al. A survey of the high-field 1H-NMR spectra of the steroid hormones， their hydroxylated derivatives， and related compounds[J]. Journal of the Chemical Society-Perkin Transactions， 1990（9）：1567-1594.

[5] FERNANDES P， CRUZ A， ANGELOVA B， et al. Microbial conversion of steroid compounds： recent developments [J]. Enzyme and Microbial Technology，2003，32（6）：688-705.

[6] TONG W Y， DONG X. Microbial biotransformation： Recent developments on steroid drugs[J]. Recent patents on biotechnology，2009，3（2）：141-153.

[7] TORSHABI M， BADIEE M， FARAMARZI M A， et al. Biotransformation of methyltestosterone by the filamentous fungus mucor racemosus[J]. Chemistry of Natural Compounds，2011， 47（1）：59-63.

[8] FARAMARZI M A， ZOLFAGHARY N， YAZDI M T， et al. Microbial conversion of androst-1，4-dien-3，17-dione by mucor racemosus to hydroxysteroid-1，4-dien-3-one derivatives[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2009，84（7）：1021-1025.

[9] GE W， WANG S， SHAN L， et al. Transformation of 3 beta-hydroxy-5-en-steroids by mucor racemosus[J]. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic，2008，55（1-2）：37-42.

[10] GE W Z， LI N， SHAN L H， et al. Microbial transformation of 4-ene-3-one steroids by mucor racemosus [J]. Acta Microbiologica Sinica，2007，47（3）：540-543.

[11] FARAMARZI M A， BADIEE M， YAZDI M T， et al. Formation of hydroxysteroid derivatives from androst-4-en-3，17-dione by the filamentous fungus mucor racemosus[J]. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic， 2008， 50（1）：7-12.

[12] BLUNT J W， STOTHERS J B. C-13 NMR-studies .69. C-13 NMR-spectra of steroids-survey and commentary [J]. Organic Magnetic Resonance， 1977， 9（8）：439-464.

[13] BRYAN M B， SCOTT A P， CERNY I， et al. 15 alpha-hydroxyprogesterone in male sea lampreys，petromyzon marinus L[J]. Steroids，2004，69（7）：473-481.

[14] CHOUDHARY M I， BATOOL I， SHAH S A， et al. Microbial hydroxylation of pregnenolone derivatives[J]. Chem Pharm Bull（Tokyo），2005，53（11）：1455-1459.

[15] FARAMARZI M A， TABATBAEI Y M， AMINI M， et al. Microbial hydroxylation of progesterone with acremonium strictum[J]. FEMS Microbiol Lett，2003，222（2）：183-186.

[16] CHOUDHARY M I， MUHAMMAD N， SHAMSUN N K， et al. Microbial hydroxylation of hydroxyprogesterones and α-glucosidase inhibition activity of their metabolites[J]. Z. Naturforsch，2007（62b）：593-599.

[17] 王明媚.手性药物的制备方法[J]. 医药导报，2006，25（4）：325-327.

[18] 杜娟娟，陈红莉，李援朝. 甾体类细胞色素 P450 17α酶抑制剂的研究进展[J]. 药学学报，2013，48（1）：25-31.

转化产物6还发生了1位的脱氢，表现出菌株转化多样性。说明总状毛霉不但有羟化酶存在，而且还有脱氢酶的存在，羟基化酶和脱氢酶属于细胞色素P450酶系[18]，这也说明细胞色素P450酶系的多样性，为其在其他甾体药物及药物中间体转化中的应用提供了依据。

参考文献：

[1] MURRAY H C， PETERSON D H. Oxygenation of steroids by mucorales fungi [P]. U. S.： Patant 2602769，1952.1952-07-08.

[2] 张丽清.微生物转化在甾体药物合成中的应用[J].医药工业，1985，16（1）：37-41.

[3] MAHATO S B， GARAI S. Advances in Microbial Steroid Biotransformation[J]. Steroids， 1997，62（4）：332-345.

[4] KIRK D N， TOMS H C， DOUGLAS C， et al. A survey of the high-field 1H-NMR spectra of the steroid hormones， their hydroxylated derivatives， and related compounds[J]. Journal of the Chemical Society-Perkin Transactions， 1990（9）：1567-1594.

[5] FERNANDES P， CRUZ A， ANGELOVA B， et al. Microbial conversion of steroid compounds： recent developments [J]. Enzyme and Microbial Technology，2003，32（6）：688-705.

[6] TONG W Y， DONG X. Microbial biotransformation： Recent developments on steroid drugs[J]. Recent patents on biotechnology，2009，3（2）：141-153.

[7] TORSHABI M， BADIEE M， FARAMARZI M A， et al. Biotransformation of methyltestosterone by the filamentous fungus mucor racemosus[J]. Chemistry of Natural Compounds，2011， 47（1）：59-63.

[8] FARAMARZI M A， ZOLFAGHARY N， YAZDI M T， et al. Microbial conversion of androst-1，4-dien-3，17-dione by mucor racemosus to hydroxysteroid-1，4-dien-3-one derivatives[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2009，84（7）：1021-1025.

[9] GE W， WANG S， SHAN L， et al. Transformation of 3 beta-hydroxy-5-en-steroids by mucor racemosus[J]. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic，2008，55（1-2）：37-42.

[10] GE W Z， LI N， SHAN L H， et al. Microbial transformation of 4-ene-3-one steroids by mucor racemosus [J]. Acta Microbiologica Sinica，2007，47（3）：540-543.

[11] FARAMARZI M A， BADIEE M， YAZDI M T， et al. Formation of hydroxysteroid derivatives from androst-4-en-3，17-dione by the filamentous fungus mucor racemosus[J]. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic， 2008， 50（1）：7-12.

[12] BLUNT J W， STOTHERS J B. C-13 NMR-studies .69. C-13 NMR-spectra of steroids-survey and commentary [J]. Organic Magnetic Resonance， 1977， 9（8）：439-464.

[13] BRYAN M B， SCOTT A P， CERNY I， et al. 15 alpha-hydroxyprogesterone in male sea lampreys，petromyzon marinus L[J]. Steroids，2004，69（7）：473-481.

[14] CHOUDHARY M I， BATOOL I， SHAH S A， et al. Microbial hydroxylation of pregnenolone derivatives[J]. Chem Pharm Bull（Tokyo），2005，53（11）：1455-1459.

[15] FARAMARZI M A， TABATBAEI Y M， AMINI M， et al. Microbial hydroxylation of progesterone with acremonium strictum[J]. FEMS Microbiol Lett，2003，222（2）：183-186.

[16] CHOUDHARY M I， MUHAMMAD N， SHAMSUN N K， et al. Microbial hydroxylation of hydroxyprogesterones and α-glucosidase inhibition activity of their metabolites[J]. Z. Naturforsch，2007（62b）：593-599.

[17] 王明媚.手性药物的制备方法[J]. 医药导报，2006，25（4）：325-327.

[18] 杜娟娟，陈红莉，李援朝. 甾体类细胞色素 P450 17α酶抑制剂的研究进展[J]. 药学学报，2013，48（1）：25-31.