一株产生物活性物质放线菌的分离鉴定

詹建立，陈 芸，陈 涛

（喀什师范学院生物与地理科学系，新疆喀什 840006）

一株产生物活性物质放线菌的分离鉴定

詹建立，陈 芸，陈 涛

（喀什师范学院生物与地理科学系，新疆喀什 840006）

基于16S rRNA序列分析，本文对塔什库尔干县土壤中的放线菌进行了初步分离和鉴定。通过平板培养法，对分离鉴定的放线菌菌株进行活性物质的分析和研究，从塔县土壤中分离得到8株放线菌，其中CT-1产生的活性物质能够抑制Bacillus subtilis。从8株放线菌选出3株16S rRNA的序列分析，推断放线菌CT-1，CT-3和CT-7菌株同属于内芽孢杆菌属（Paenibacillus）。实验表明，这3株放线菌虽然来源相同却有不同的生理生化特性。

塔什库尔干县放线菌资源；16S rRNA基因；进化树；活性物质

放线菌（Actinomycetes）是与人类关系极为密切的微生物。从微生物中发现的大约8 000种生物活性物质中，近70%源自放线菌［1］。目前临床上使用的抗生素有三分之二来自放线菌［2］。因此，作为一类重要的微生物资源，放线菌的研究受到了世界各国学者的极大重视。其中放线菌的分类鉴定工作是这些研究的基础。常显波［3］比较了不同方法的分离效果，并通过纯培养和16S rDNA系统发育分析对黄海冷水团、北极海区及青岛盐池的沉积物样品进行了放线菌多样性研究。赵邑尘［4］等人研究了青海高寒生态区油菜地土壤中放线菌组成及其对油菜菌核病、黑斑病及软腐病的拮抗性，为克服青海油菜连作障碍提供了放线菌生态依据及拮抗性生防放线菌菌株。另外，放线菌多样性的研究也是一个比较热门的方向［5-7］。Letek M等人对放线菌的细胞骨架蛋白进行了研究［8］。也有学者探讨了放线菌的16SrRNA基因和蛋白质的进化关系［9］。

目前，放线菌的研究主要集中在对放线菌来源的生物活性物质、放线菌分类学和放线菌遗传学等方面。塔什库尔干塔吉克自治县位于新疆南部，属寒温带干旱气候区，极端最高气温32.0℃，极端最低气温-39.1℃。塔县的放线菌资源研究尚属空白，本研究对塔县放线菌进行分类研究，同时对其生物活性物质进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

培养基：高氏Ⅰ号培养基、明胶液化和淀粉水解实验等试剂按照文献［10］配制。

主要试剂：PCR PreMix，EDTA-Na2，Tris，CTAB，EB，SDS和Agarose等购自大连宝生物有限公司（TaKaRa）。

16S rRNA引物：P1（5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'）和P2（5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'）委托上海杰瑞有限责任公司合成。DNA回收使用TaKaRa公司的the Gel Extraction Mini Kit（50次）。

1.2 方法

样品采样地点为塔什库尔干县土壤。采样方法、土样的预处理、土壤悬液制备参考文献［11］进行，涂布后的平板于28℃恒温培养1 h后，倒置平板继续培养于28℃恒温箱中，培养（18-24）h。塔什库尔干县放线菌的总DNA的提取采用CTAB法［12］。

塔什库尔干县放线菌的16S rRNA基因扩增：将总DNA作为PCR扩增的模板，终浓度约为1 nmol/100μL。DNA扩增反应在25μL反应体系中进行，包括9.5μL无菌水，1μL引物P1，1 μL引物P2，12.5μLTaq酶和1μL模板总DNA。PCR反应条件：94℃，3 min；55℃，30 sec；72℃，1 min。

用DNA胶回收试剂盒对塔什库尔干县放线菌的16S rRNA基因克隆的产物纯化进行回收和纯化。委托北京奥科鼎盛有限责任公司对扩增产物进行测序。测序结果通过http：//www.ncbi. nih.nlm.gov网站进行BLAST序列比对，同时，利用Mega4.1软件构建系统进化树。

塔什库尔干县放线菌的生理生化实验如明胶液化、牛乳胨化和淀粉水解等参照文献［10］进行。然后对塔什库尔干县分离到的8株放线菌对Escherichia coli，Proteus vulgaris，Staphylococcus aureus和Bacillus subtilis进行抑菌活性的检测。

2 结果与讨论

2.1 放线菌的分离与分类

依据形态学特征，本研究初步从塔县土壤中分离得到8株放线菌，对这8株放线菌进行总DNA提取，从中选出3株放线菌的总DNA，分别是CT-1，CT-3和CT-7，对其总DNA进行PCR和胶回收纯化，得到约1 500 bp的16S rRNA基因片段（见图1）。

图1 分离放线菌菌株的16S rRNA基因片段纯化电泳

2.2 放线菌16S rRNA的序列分析

塔县三株放线菌CT-1，CT-3和CT-7的 16S rRNA基因片段的基因注册号分别是JQ907274（1 424 bp）、JQ907274（1 422 bp）和JQ907274（1 418 bp）。

本研究通过NCBI网站对扩增的3株放线菌CT-1，CT-3和CT-7菌株的16S rRNA基因序列进行比对。结果表明，CT-1和CT-3与Paenibacillus sp.（HQ437166）有99%的同源性，且处于同一分支上；CT-7与Paenibacillus xylanexedens在同一个分支上，具有99%的同源性。因此，初步推断放线菌CT-1，CT-3和CT-7菌株同属于内芽孢杆菌属（Paenibacillus）（见图2）。

2.3 放线菌的生理生化实验

生理生化实验结果表明，CT-1水解淀粉，而CT-3和CT-7不能水解淀粉；CT-1，CT-3和CT-7菌株均能使明胶液化，CT-3的液化能力最强，CT-1菌株的液化能力最差；而且CT-1，CT-3和CT-7菌株均能使牛乳酸凝（见表1）。可以看出，3株放线菌虽然分离自同一地点，但是其生理生化性质上存在差异。

表1 分离放线菌菌株的生理生化实验

2.4 放线菌活性物质分析

放线菌的部分有效产物对某些菌株具有一定的抑制作用。本研究通过滤纸片点试法对Escherichia coli，Proteus vulgaris，Staphylococcus aureus和Bacillus subtilis四种菌株进行了抑菌实验。结果表明，放线菌CT-1菌株在Bacillus subtilis平板上出现了透明圈，直径大约1 cm。因此，放线菌CT-1菌株产生的活性产物能够抑制Bacillus subtilis（见图3）。

3 结 论

从塔县土壤中分离得到8株放线菌，其中CT -1产生的活性物质能够抑制Bacillus subtilis。从8株放线菌选出3株16S rRNA的序列分析，推断放线菌CT-1，CT-3和CT-7菌株同属于内芽孢杆菌属（Paenibacillus）。实验表明，这3株放线菌虽然来源相同却有不同的生理生化特性。

图2 分离放线菌CT-1，CT-3和CT-7菌株的系统进化树

图3 8株放线菌对枯草芽孢杆菌的抑菌作用

［1］杨宇容，徐丽华.放线菌分离方法的研究［J］.微生物学通报，1995，22（2）：88-91.

［2］姜成林.放线菌分类学［M］.昆明：云南大学出版社，1995：3 -24.

［3］常显波.不同环境海洋放线菌多样性研究及2株放线菌新菌的分类鉴定［D］.中国海洋大学，2011：4-12.

［4］赵邑尘，薛泉宏，白霜，等.青海高寒地区油菜地土壤中放线菌组成及拮抗性放线菌研究［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2009，7：176-182.

［5］江红，林如，陈路劼，等.智利海洋沉积物中放线菌多样性［J］.微生物学报，2010，30（7）：862-869.

［6］夏占峰，关统伟，阮继生，等.艾丁湖沉积物放线菌多样性［J］.微生物学报，2011，51（8）：1023-1030.

［7］Xingxing Peng，Zaili Zhang，Ziling Zhao，et al.16S ribosomal DNA clone libraries to reveal bacterial diversity in anaerobic reactor-degraded tetrabromobisphenol A［J］.Bioresource Technology，2012，112（5）：75-82.

［8］Michal Letek，María Fiuza，Almudena F，et al.Cytoskeletal Proteins of Actinobacteria［J］.International Journal of Cell Biology，2012，2：1-10.

［9］Zhitang Lu，Weiwei Zhang.Comparative Phylogenies of Ribosomal Proteins and the 16S rRNA Gene at Higher Ranks of the Class Actinobacteria［J］.Currrent Microbiology，2012，4：1-6.

［10］东秀株，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001.

［11］沈萍，陈向东.微生物学实验［M］.北京：高等教育出版社，2008：85-88.

［12］Zhou JZ，Bruns MA，Tiedje JM.DNA recovery from soils of diverse composition［J］.Applied and Environmental Microbiology，1996，62（2）：316-322.

Isolation and Identification of a Strain of Actinomycetes Producing Bioactive Substance

ZHAN Jian-li，CHEN yun，CHEN Tao
（Department of Biological and Geographical Science，Kashi Normal College，Kashi844006，China）

Based on the analysis of16S rRNA sequence，this study isolated and identified actinomycetes isolated from the soil of Taxkorgan County.Then，by themethod of culturing on the plates，we analyzed and studied the active substance of the isolated actinomycetes.It is shown that the three separated actinomycetes possibly belonged to the genus of Paenibacillus，and their physiological and biochemical charateristics are different.Meanwhile，the strains of actinomycetes CT-1 had the antibacterial effects on Bacillus subtilis.

actinomycetes resources of Taxkorgan County，16S rRNA gene，PCR，sequence alignment，evolutionary tree

Q936

A

1007-4260（2014）03-0106-03

时间：2014-9-15 16：07 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/doi/10.13757/j.cnki.cn34-1150/n.2014.03.026.html

2013-12-21

新疆维吾尔自治区高校课题（XJEDU2011S38）资助。

詹建立，男，山东宁津人，理学硕士，喀什师范学院生物与地理科学系副教授，主要从事生物化学教学和微生物生态领域的研究。