分子标记辅助选择技术及其在水稻定向改良上的应用研究进展

吴昊+陈涛+姚姝等

摘要：综述了分子标记的概念、特点、种类，对分子标记辅助选择技术的优势和影响因素进行了介绍，同时对其在质量性状（稻米品质、抗病、抗虫性等）改良和数量性状（稻米产量、抗逆性、株型等）改良两方面的研究进展进行了归纳，并对研究中出现的问题进行了分析，对其应用前景进行了展望。

关键词：分子标记辅助选择；水稻；质量性状；数量性状；定向改良；研究进展

中图分类号： S511.035文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0022-06

收稿日期：2013-07-02

基金项目：现代农业产业技术体系建设专项（编号：CARS-01-47）；农业部超级晚稻新品种选育和示范项目；江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（12）1003]；江苏省科技支撑计划（编号：BE2013301）。

作者简介：吴昊（1988—），男，河南驻马店人，硕士，主要从事水稻遗传育种研究。E-mail：wuhao11219@gmail.com。

通信作者：王才林（1959—），男，江苏无锡人，博士，研究员，博士生导师，主要从事水稻遗传育种研究。Tel：（025）84390307；E-mail：clwang@jaas.ac.cn。水稻（Oryza sativa L.）是世界上大多数人的主要食物，在除南极洲和北极洲之外的各大洲均有种植，面积超过1.5亿hm2[1]，但主要产区在亚洲。20世纪60年代，国际水稻研究所（IRRI）推动的“绿色革命”以及我国杂交水稻的研制成功大幅度提高了水稻产量。然而在过去的10多年里，水稻产量停滞不前。为了填补不断增加的世界人口所造成的粮食缺口，进一步提高水稻产量是育种工作者们刻不容缓的任务。但是，传统的育种方法主要是依据作物在田间的表现进行评价和选择，要求育种工作者具有非常丰富的育种经验，而且需要长达数年的时间。另外，对一些数量性状的直接选择还受到许多条件的限制。因此，提高选择效率并减少育种过程中的盲目性成为进一步拓展品种生产力的关键[2]。

近20年来迅速发展起来的基于DNA的分子标记技术为育种工作提供了崭新的途径。国内外育种工作者对分子标记辅助选择技术（molecular marker-assisted selection，MAS）做了很多有益的尝试，并以此改良或育成了不少品种，其中一些已开始在生产上应用。本文综述了分子标记辅助选择的概念、特点、种类，重点介绍了分子标记辅助选择技术在改良水稻质量性状、数量性状两方面的研究进展和利用现状，同时讨论了该技术存在的问题，并展望了其应用前景。

1DNA分子标记和分子标记辅助育种技术

1.1DNA分子标记的概念及特点

在遗传学的发展中，先后出现了形态标记、细胞标记、生化标记和分子标记[3]。相对于传统的形态标记来说，分子标记有着众多的优势。最近利用分子标记进行水稻品种的改良上有很多的报道，这些报道主要涉及强调了分子标记在一般作物改良及杂种优势育种中的应用及其使用限制[4-9]。DNA分子标记较以往的形态标记具有减少育种时间、表现为中性、操作简便高效、能更准确地选择复杂性状等特点。

1.2DNA分子标记的种类

根据王军等的研究[10-13]，并作部分增添和删改，将分子标记划分为3代4类（表1）。 第1代分子标记是以Southern杂交为核心的分子标记技术。第2代分子标记技术主要分为2类：第1类为基于PCR（polymerase chain reaction，多聚链式反应）的DNA分子标记，根据所用引物的差异，该类标记又分为随机引物PCR标记、特异引物PCR标记2种；第2类为基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记。第3代分子标记技术是基于单核苷酸多态性的DNA分子标记。

1.3分子标记辅助选择技术

分子标记辅助选择技术是将上述分子标记应用于作物育种或改良的一种手段[14]，其基本原理是利用与目标基因紧密连锁或共分离的分子标记对选择个体进行目标基因以及全基因组筛选，从而减少连锁累赘，以获得所需的个体，达到提高育种效率的目的[15-16]。主要分子标记原理及特点见表2。MAS是分子标记技术用于作物改良的重要领域，是常规育种技术和现代生物技术相结合的产物。

1.3.1分子标记辅助选择技术的优越性通过大量理论研究发现，相比常规的育种技术，MAS有很大的优越性。辅助选择可以在植物发育的任何阶段进行，而且不受基因表达和环境因素的影响；共显性标记可区分纯合基因型和杂合基因型，所以能在分离世代的早期进行选择；对一些表型鉴定困难的性状（如抗病性、抗逆性等）也可进行基因型鉴定；可聚合多个控制不同性状的基因以提高育种效率，延长品种使用年限[17]。

1.3.2影响分子标记辅助选择技术的主要因素MAS虽是提高选择效率的一种有效方法，但由于其研究设计的内容广泛，有很多遗传和生物学的因素影响其效率，如基因与标记间表1分子标记的分类及名称

代别类别种类缩写全称第1代RFLPrestriction fragment length polymorphism，限制性内切酶片段长度多态性第2代第1类第1种RAPDrandom amplified polymorphic DNA，DNA随机扩增多态性ISSRinter-simple sequence repeats，内部简单重复序列AP-PCRarbitrarily primed polymerase chain reaction，任意引物PCRDAFDNA amplification fingerprinting，DNA扩增指纹印记第2种SSRsimple sequence repeats，简单重复序列STSsequence-tagged site，序列标记位点SCARsequence-characterized amplified region，序列特异性扩增区SPARsingle primer amplification reaction，单引物扩增反应SSCPsingle strand conformation polymorphism，DNA单链构象多态性ddFdideoxy fingerprints，双脱氧化指纹法第2类AFLPamplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性CAPScleaved amplified polymorphic sequence，酶切扩增多态性序列第3代SNPsingle nucleotide polymorphisms，单核苷酸多态性

2分子标记辅助选择技术在水稻品种改良上的应用

2.1分子标记辅助选择技术在水稻质量性状改良上的应用

2.1.1稻米食味品质改良刘巧泉等经过回交转育并结合分子标记辅助选择技术向特青品种导入Wx基因，在保持原有亲本主要农艺性状的基础上选育了3个优质品系，改良品系胚乳突变基因表达量明显下降，稻米中直链淀粉含量减少[18]。周屹锋等以具有中等直链淀粉含量的优质保持系宜香1B为优质源，与协青早B杂交、回交和自交，在分离早世代以特异性分子标记对直链淀粉含量进行检测和选择，最终选育出具有中等直链淀粉含量的的籼型三系不育系浙农3A[19]。许勇等以分子标记辅助选择对协优57的父母本的Wx基因进行改良，利用改良后的亲本进行配组，其后代杂交稻米的AC值降到中等偏低水平，蒸煮食味品质明显改善[20]。夏明元等利用Wx基因的CAPS标记对4384/舟903//4384的杂交后代进行单株选择，经过7代的选育，获得92个Wx基因纯合的株系，从中选出2个产量较高及直链淀粉含量适中的品系[21]。李浩杰等以美国光身稻Lemont为优质基因供体亲本，优良保持系冈46B为轮回亲本，利用与Wx基因紧密连锁的分子标记484/485进行目标基因型选择，同时进行冈46B的背景选择，选出具有中等直链淀粉含量且综合性状与轮回亲本冈46B相似的个体，从而提高育种效率[22]。

2.1.2抗病性水稻条纹叶枯病（rice stripe disease，RSD）是由灰飞虱作为传毒媒介的水稻条纹叶枯病毒（rice stripe virus，RSV）引起的病毒病。因此水稻对该病的抗性可分为对病毒的抗性和对介体昆虫的抗性，其中对病毒的抗性更为重要[23]。目前，已经定位的水稻条纹叶枯病抗性相关的QTL有40多个，它们分布于第1、2、3、5、6、7、8、10、11等9条染色体[24-33]。然而这些QTL中能实际用于生产的却很少，目前国内外生产上应用的条纹叶枯病抗性品种大多是利用来自籼稻Modan的位于第11染色体上的Stv-bi基因[34]。潘学彪等为了改良武育粳3号的条纹叶枯病抗性，在连续回交和自交过程中，以紧密连锁的双侧分子标记Stv-bi对其进行选择，在短期内育成抗条纹叶枯病的武陵粳1号，大幅度提高了其条纹叶枯病抗性水平[35]。陈峰等利用与Stv-bi紧密连锁的分子标记进行辅助选择，结合条纹叶枯病田间抗性鉴定及农艺性状分析，通过回交改良，获得携带Stv-bi的改良品系6个[36]。李波利用与抗病基因qSTV-11b、qSTV-11c连锁的分子标记对武育粳3号、武运粳8号和武运粳7号进行辅助选择，改良受体亲本的抗性，并选育对条纹叶枯病具有抗性的新品种[37]。马宁以抗病品种镇稻 88为供体亲本、武育粳3号为轮回受体亲本，采用连续回交并结合分子标记辅助选择的方法，将抗条纹叶枯病基因转移到武育粳3号中，育成武育粳3号改良系[38]。

水稻白叶枯病（bacterial leaf blight，BB）是由革兰氏阴性菌黄单胞菌水稻变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）引起的细菌性病害，化学方法难以奏效，种植抗病品种则是最经济、有效的防治方法。目前已有32个抗白叶枯病基因被鉴定，分别位于第1、4、5、6、8、11、12染色体上[39]。其中，Xa1、Xa5、Xa13、 Xa21、Xa26、Xa27已被克隆。王兴春等以受微效多基因控制白叶枯病抗性的五丰占2号和主基因Xa5控制的IRBB5为材料，成功地聚合了白叶枯病抗性主基因和微效多基因[40]。薛庆中等利用MAS成功地选育了抗白叶枯病的水稻恢复系[41]。彭应财等把白叶枯病抗性基因Xa21导入到强优恢复系辐恢838中，选育出抗白叶枯病恢复系中恢218[42]。兰艳荣等利用抗性基因Xa21、Xa7，成功改良了华201S的白叶枯病抗性[43]。

稻瘟病是由子囊菌引起的真菌性病害，是世界性的主要稻病之一。应用抗病品种防治相对化学防治来说不会污染环境，是如今防治稻瘟病的主要方法。自20世纪60年代日本开展稻瘟病基因的遗传研究以来，至今水稻中已经有80多个抗稻瘟病基因被标记定位，其中13个已经克隆[44]。被鉴定的广谱抗性基因包括Pi1、Pi2、Pi3、Pi9、Pi33、Piz、Piz-t、Pigm（t）等[45]。利用与这些基因连锁的分子标记，通过MAS已经育成了许多抗病品种。王忠华等应用与Pi-ta连锁的共显性标记对350个杂交F3代株系进行早期筛选，得到118个含Pi-ta的抗病纯合株系[46]。刘士平等利用位于第11染色体上的与Pi1紧密连锁的SSR标记对保持系珍汕97进行改良，得到17株含Pi1的纯合株系[47]。倪大虎等分别将Pi9导入不同水稻恢复系M12和闽恢3139中。这些育成的改良品系经抗性鉴定，抗瘟性均得到显著提高[48-49]。陈志伟等将稻瘟病抗性基因Pi1导入受体亲本珍汕97B、金山B-1、金山 S-1 等保持系中，用与Pi1基因紧密连锁的分子标记RM224和MRG4766同时对杂种后代Pi1基因进行MAS选择的准确率高达100%，中选单株抗病性明显提高[50]。

2.1.3抗虫性不同生物型的稻褐飞虱在侵染具有不同抗性基因的水稻时会表现出不同程度的致害性。迄今为止，已报道的水稻抗褐飞虱基因共27个，定位的有21个，其中Bph14已被成功克隆[51]。胡杰等利用分子标记辅助选择将水稻抗褐飞虱基因Bph14、Bph15同时导入到汕优63的亲本明恢63、珍汕97B中，以改良汕优63的褐飞虱抗性[52]。李信通过分子标记辅助选择技术将抗褐飞虱基因Qbp1、Qbp2导入到明恢63、珍汕97中，提高明恢63、珍汕97对稻褐飞虱的抗性[53]。梁云涛利用MAS，将对我国稻褐飞虱生物群体表现为高抗的Bph18（t）基因导入到优质杂交水稻恢复系 9311、测253中，选育优质高抗的水稻中间材料[54]。李进波等以药用野生稻渗入系B5为供体亲本，以9311、1826为受体亲本，利用MAS结合田间农艺性状的选择，获得了目标基因Bph14、Bph15纯合的稳定株系[55]。孙荣科等以携带Bph2、Bph3的水稻品系ME1为供体亲本与杂交稻亲本进行杂交、回交和自交，结合分子标记辅助选择，成功获得了双基因纯合的株系[56]。

稻瘿蚊同样具有不同的生物型。目前国际上已鉴定出9个稻瘿蚊抗性基因，分别命名为Gm1至Gm9，不同的基因抗不同的生物型。目前抗性育种进程中主要利用的是Gm6基因。柳武革等通过杂交、多次回交和自交结合分子标记辅助选择技术，将Gm6基因导入广恢998中，筛选获得6个抗性株系[57]。黄炳超等利用与Gm6紧密连锁的分子标记，成功从丰银占/大秋其F3家系中，鉴定出15个抗稻瘿蚊的株系，随后从抗蚊青占/桂99的F4和F6家系中分别鉴定出21个和7个抗稻瘿蚊株系，并成功地将Gm6基因转入杂交稻的恢复系[58]。

稻螟虫（包括二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟）是水稻的主要害虫，但由于自然界缺乏优良的抗虫资源，水稻抗螟虫育种研究进展不大。近年来，随着转基因技术的成功应用，抗螟虫水稻品种培育已成为可能。研究表明，种植带有Bt基因的品种可以有效控制螟虫的危害。杨子贤等利用常规回交育种方法并结合分子标记辅助选择将Bt基因导入9311中，在BC3F3家系中筛选到8个家系含纯合的Bt基因。抗性鉴定结果表明，带有Bt基因的株系及其杂交种没有受到螟虫危害[59]。沈圣泉等以克螟稻为Bt抗虫基因供体，采用杂交、回交转育方法，结合GUS（β-葡萄糖苷酸酶）分子标记辅助选择和田间抗螟虫性选择技术，选育出首个转Bt抗螟虫基因籼型水稻不育系科龙A，其所配杂种F1代仍保持了高抗螟虫特性[60]。

2.1.4多个质量性状基因的聚合基因聚合是将多个有利基因通过选育途径聚合到一个品种中，这些基因可以控制相同的性状，也可控制不同的性状，基因聚合突破了回交育种改良个别性状的局限，使品种在多个性状上同时得到改良，产生更具有实用价值的育种材料[61]。随着利用水稻抗病虫基因育成水稻品种的不断推广，新的病原菌小种或害虫生物型不断出现，促使抗病虫品种需要不断更新[62]。但由于各种病原微生物和害虫类型的易变性，采用单基因品种控制病虫害就存在较大的风险，容易因单基因抗性丧失带来较大的病虫害发生；而且不同抗病虫基因间还存在一定的协同作用，聚合多个不同类型的抗病虫基因将是解决水稻病虫害问题的切实有效的方法[63]。

王春连等利用与抗白叶枯病基因Xa23紧密连锁的EST（expressed sequence tag，表达序列标签）标记，培育出了3个含Xa23的水稻恢复系[64]。Yoshimura等通过RFLP和RAPD标记将来自不同组合的5个白叶枯病抗性基因Xal、Xa3、Xa4、Xas、Xa10聚合在一起[65]。Hittalmani等利用分子标记辅助选择技术将抗稻瘟病基因Pi1、Pi-z5、Pi-ta聚合到同一个水稻品系BI124中，含有2个或3个抗性基因的植株比含单个基因的抗性更强[66]。Narayanan等先通过分子标记辅助选择将稻瘟病抗性基因Pi1、Pi-z5聚合到C039中，再将白叶枯病抗性基因Xa21转到已经聚合了稻瘟病抗性基因的C039植株中，最后得到同时含有Pi1、Pi-z5、Xa21的植株，这些植株对稻瘟病和白叶枯病的抗性有很大提高[67]。陈圣等利用分子标记辅助选择将高抗水稻白叶枯病的Xa23基因、广谱高抗稻瘟病的Pi9基因、抗水稻螟虫和稻纵卷叶螟的Bt基因聚合到同一株系中，获得了与3种基因抗性水平相当的纯合株系[68]。

2.2分子标记辅助选择技术在改良水稻数量性状上的应用

2.2.1产量性状庄杰云等应用两种定位方法，比较了不同世代水稻产量性状的QTL检测结果，结果显示对产量这一性状而言，重要的加性效应的QTL能够在不同世代得到稳定检测[69]。中国水稻研究所通过分子标记辅助选择与常规测恢相结合，选育出强优恢复系R8006；应用籼粳特异标记检测，选育出籼粳中间型恢复系R9308[70]。国家杂交水稻工程中心在马来西亚普通野生稻中鉴定出2个主效高产QTLyld1.1和yld1.2的单株作基因供体，经连续回交并多代自交，采用分子标记辅助选择与田间选择相结合，育成携带野生稻高产QTL的强优晚稻恢复系Q611[71]。Tanksley等利用分子标记辅助选择实现了多个QTL从野生近缘种向优良的栽培稻品种的转移[72]。

2.2.2水稻抗逆性状的改良随着全球变暖等气候条件变化的加剧，中国旱灾发生的频率和范围也在加大，干旱已成为制约中国水稻生产的重要因素[73]，因此，水稻抗旱品种的培育对减少旱灾的影响、提高水稻产量具有十分重要的意义。迄今为止，已定位出水稻抗旱性相关的QTL超过680个，其中与根形态性状相关的QTL有228 个，与生理特征（脱落酸、渗透调节、相对含水量）相关的QTL有40个，其他与植株抗旱性相关的QTL有418个[74-75]。Li 等描述了通过建立等基因导入系进行抗旱性基因定位和利用分子技术进行抗旱性品种选育的方法，如DTY3.1、DTY1.1、DTY12.1等与干旱胁迫下产量性状紧密连锁的标记被有效用于抗旱分子辅助育种中，可以对杂交后代进行有效抗旱分子筛选[76]。刘立峰对定位群体中的粳型抗旱供体亲本IRAT109与粳型旱敏感的水稻品种越富、津稻1187进行杂交、回交，并利用分子标记辅助选择对其产生的4个低世代育种群体进行筛选，获得了抗旱相关性状QTL的优良近等基因系[77]。

水稻的多个生长期都是低温敏感期，如芽期、苗期、孕穗期和抽穗期等。全国低温、冷害造成的损失每年大概 30亿～50亿kg。近几十年来，随着分子生物学的发展，水稻耐冷性QTLs分析有了较大进展，成为了一种进行耐冷性基因定位的主要方法[78]。刘之熙等以北海PL5（孕穗期耐冷性极强）为供体亲本，与晚稻品种湘晚籼29号、湘晚籼31号及台中101号（孕穗期不耐冷）杂交，在F3代利用CAPS标记进行辅助选择，从3个F3群体中，共选出携带纯合耐冷基因的个体12株，并将其作为改良晚籼稻孕穗期耐冷性的中间材料[79]。

盐害是导致水稻减产的重要原因之一，而我国土壤的盐碱化直接制约了水稻生产的稳定发展。培育耐盐水稻品种，深入开展水稻耐盐性研究，通过遗传改良提高水稻的耐盐性，是保证盐碱稻作区粮食的安全生产和改善生态环境的有效途径之一。目前，已定位的耐盐性QTL 达70多个[80]。已经克隆的抗盐性基因包括有抗水分胁迫基因CMO、BADH、mtlD、gutD、SAMDC；另一类是抗离子毒害的基因SKC1[81]。2005年，中国水稻研究所开始通过转基因和常规育种相结合的方法在水稻中聚合这两类耐盐基因，已获得一系列的含不同抗盐途径的耐盐水稻品系越光-SKC1/BADH-12、秀水11-SKC1/BADH-23，能在1.0%的NaCl 浓度胁迫后恢复正常生长[82]。

2.2.3其他数量性状的改良水稻的株型是其产量的影响因素之一，而直立密穗是高产的合适株型。程朝平等以优良籼稻品种东南恢602（弯穗型）为母本、DW135（直立密穗）为父本配制杂交组合，设计合成InDel（insertion deletion length polymorphism，插入缺失长度多态性）标记，通过该标记进行辅助选择，最终选出了含有直立密穗基因的纯合株系[83]。

为了选育香稻恢复系，杜雪树等以广东香稻品种美香占为香味基因供体、自育抗性恢复系丰986和R476为受体，通过比较编码BAD2（betaine-aldehyde dehydrogenase，甜菜碱醛脱氢酶）的fgr基因序列和9311序列设计功能性STS标记Aro，并在回交和复交的分离世代利用Aro标记开展香味基因的分子标记辅助选择育种，最终选育出农艺性状较好的香型恢复系C349 和C354[84]。

3分子标记辅助选择的问题与展望

分子标记辅助选择是当今水稻育种中不可或缺的一部分，在培育超级稻、抗病虫及稻米品质、农艺性状改良等方面表现出了极大的潜力。从上述的例子也可以看到，分子标记辅助选择能够达到较高的准确性。但从某些方面来说，分子标记辅助选择在现阶段也显露出了一些不足。首先，目前基因定位的工作进度还不够快，育种工作者准备用分子标记辅助选择的基因有些尚未定位或连锁并不紧密；已经精确定位的，随即可用的以PCR为基础的标记还不多，而且也不一定在群体的双亲间表现多态。其次，分子标记辅助选择在改良数量性状方面的应用不如最初设想的那么广泛，主要是因为水稻农艺性状基因发掘不足，大量的遗传信息处于零散的状态，而且对不同遗传背景和环境条件下的QTL研究不够系统全面，如今已定位的DNA分子标记与目的基因间的遗传距离多数超过5.0 cmol，QTL定位的准确性和精确度达不到分子标记辅助选择的要求。针对这些问题，在今后的育种工作中所构建的群体要尽可能既是遗传研究群体，又是育种群体实现基因定位与育种同步进行；寻找与目标基因紧密连锁的两侧的分子标记；充分发掘QTL的信息等。

我们相信，在不远的将来，随着分子生物学新成果和新技术的不断出现以及基因组学、生物信息学等研究的深入发展，分子标记辅助选择将会在品种改良中大展宏图，这必将对我国的作物改良作出革命性的贡献。

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