SREBP-1c基因多态性与非酒精性脂肪性肝病的关系研究

张海英，高燕翔，冯晓凡，张乾勇，糜漫天

·论著·

SREBP-1c基因多态性与非酒精性脂肪性肝病的关系研究

张海英，高燕翔，冯晓凡，张乾勇，糜漫天

目的 研究固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)基因多态性与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的关系。方法 选取152例NAFLD患者和146例未患脂肪肝人员，收集血液样本检测血脂水平，采用聚合酶链反应-限制线片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分析SREBP-1c基因18号外显子54G/C多态性。结果 NAFLD病例组TC、TG和LDL-C水平均明显高于对照组(P<0.05)。两组的SREBP-1c18号外显子54G/C单核苷酸多态性均以GG型的比例最高，两组基因型频率分布有统计学差异(χ2=6.1096，P<0.05)，NAFLD病例组中C等位基因频率明显高于对照组(χ2=6.2520，P<0.05)。C等位基因携带者患NAFLD的风险是G等位基因的1.6484倍(OR=1.6484，95%CI：1.3233～10.0984)。结论 研究对象的血脂水平异常与NAFLD的患病有显著相关性，参与糖代谢、脂代谢的SREBP-1c基因18号外显子54G/C呈现多态性，其C等位基因可能会使个体的NAFLD发病风险增加。

固醇调节元件结合蛋白-1c；非酒精性脂肪性肝病；基因多态性；等位基因

近年来我国非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的患病率呈现上升趋势，已经成为主要的公共卫生问题之一[1-2]。NAFLD的病因和发病机理一直争论不休，有学者曾用“盲人摸象”来形容人们对NAFLD 的认识[3]。目前，“二次打击”学说占主导地位，这一理论认为：胰岛素抵抗(IR)作为初次打击，使得肝内脂肪蓄积，导致肝细胞脂肪变性；氧应激及脂质过氧化损伤作为第二次打击，导致脂肪变的肝脏发生炎性反应、坏死和纤维化[4]。脂代谢紊乱与NAFLD发病密切相关，而固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatory element-binding proteins，SREBPs)参与机体的糖、脂代谢[5-8]，其中SREBP-1c主要参与脂肪合成相关基因的表达调控，并受胰岛素、葡萄糖等因素的调控，是代谢综合征中重要的基因调控连结点[9]。SREBP-1c基因18号外显子54G/C单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与2型糖尿病以及肥胖的发生有关[10-11]，但其与NAFLD的关系如何还缺乏相关报道。本研究应用聚合酶链反应-限制线片段长度多态性分析(PCR-RFLP)，对SREBP-1c基因18号外显子54G/C多态性进行分析，研究其多态性对血脂水平的影响及其与NAFLD发病的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2012年9～11月，在重庆西南医院体检中心征集B超检查诊断的NAFLD病例152例(其中男性96例，女性56例)，同时，按照年龄、性别、身高以及居住地等信息配比在前来体检的人群中选择未患脂肪肝的对象146例作为对照。排除标准为：(1)经常过量饮酒的人员，男性饮酒折合乙醇量>140 g/w(女性>70 g/w)；(2)年龄超过60岁；(3)有慢性肝炎病史；(4)非重庆市常住居民；(5)血糖高于7.8 mmol/L、严重高血压(>160/110 mmHg)、肾功能严重异常等患者。

1.2 方法

1.2.1 基本信息的调查 调查者与研究对象签知情同意书，调查其个人基本信息、健康状况和生活方式等，测量身高和体重。

1.2.2 DNA提取 采集NAFLD组及对照组人群抗凝血液样本，每份血液约600 μl，装入1.5 ml的离心管，采用BioFlux公司的Biospin全血基因组DNA提取试剂盒提取DNA，经紫外分光光度计测试样本DNA浓度符合试验要求，放入-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 PCR扩增 运用Primer 5.0软件设计SREBP-1c的引物，上游为5'-CCTGTGCTACTTTGCCTTTT-3'，下游是5'-GGACAGAGCTGGGAGGTG-3'，由上海赛百盛基因技术有限公司合成。PCR扩增的反应体系：依次加入DNA模板3.0 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，Mg2+1.5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μl，上、下游引物各1 μl，下游引物1 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，加双蒸水至25 μl。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性50 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸55 s，循环32次，最后72 ℃延伸5 min。

1.2.4 XmnⅠ酶切及基因型判定 酶切反应体系31 μl：PCR产物10 μl，DEPC处理水18 μl，10×Tango缓冲液2 μl，XmnⅠ限制性内切酶1 μl(Thermo 公司)，37 ℃恒温过夜(12 h)。酶切产物、PCR产物及DNA Marker(TIANGEN公司)经2%琼脂糖凝胶110 V电泳40 min，经计算机软件成像。将酶切产物、PCR产物与DNA Marker比较以确定基因型：GG型为164 bp和206 bp；GC型为164 bp、206 bp和370 bp；CC型为370 bp。

1.2.5 血脂水平测定 血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)用奥林巴斯AU2700大型全自动生化分析仪测定。

2 结果

2.1 两组基本情况 NAFLD病例组和对照组的年龄、身高基本一致，病例组的体重、BMI却显著高于对照组(P<0.05，表1)。

2.2 两组血脂水平分析 NAFLD病例组TC、TG和LDL-C明显高于对照组，而HDL-C显著低于对照组(P<0.05，表2)。

2.3 SREBP-1c基因18号外显子54G/C多态性 PCR扩增产物片段长度为370 bp。GG型基因的扩增产物可被XmnⅠ酶切，可见164 bp和206 bp两个片段；GC基因型属于杂合子，有164 bp、206 bp和370 bp三个片段；而CC基因型不能被XmnⅠ酶切，仅见370 bp一个片段(图1)。

图1 SREBP-1c基因18号外显子54G/C PCR产物及各基因型酶切片段

1、2：GC型；3、5、6、7：GG型；4:空白；8：CC型；P:未酶切PCR产物；M：DNA Marker

2.4 两组SREBP-1c基因型频率及等位基因频率分布情况 两组均以GG型的比例最高，等位基因频率均以G为优势。NAFLD病例组和对照组基因型频率分布有统计学差异(χ2=6.1096，P<0.05)；等位基因频率在NAFLD病例组和对照组中的分布也有显著差异(χ2=6.2520，P<0.05)，C等位基因携带者患NAFLD的风险是G等位基因的1.6484倍(OR=1.6484，95%CI：1.3233～10.0984)。见表3。

2.5 不同SREBP-1c基因型间血脂水平比较 NAFLD病例组TC、TG和LDL-C水平均以CC基因型患者较高，但与病例组组内GC、GG基因型患者的差异不显著(P>0.05)。对照组TG、LDL-C水平CC基因型明显高于对照组组内的GG、GC基因型(P<0.05)，而TC、HDL-C水平则在对照组组内各基因型间无明显差异(P>0.05)。见表4。

表1 两组的基本情况比较

注：与对照组比较，①P<0.05

表2 两组血脂检测结果(mmol/L)

注：与对照组比较，①P<0.05

表3 两组SREBP-1c基因18号外显子多态性分布

注：①χ2=6.1096，P<0.05；②χ2=6.2520,P<0.05

表4 SREBP-1c基因18号外显子不同基因型血脂水平分析(mmol/L)

注：与同组GC、GG基因型比较，①P<0.05

3 讨论

SREBP是一类膜连接蛋白，分别由SREBP-1和SREBP-2基因编码，有SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2三种同工型，分布于内质网和核膜上。其中SREBP-1a、SREBP-1c主要调节脂肪酸(FFA)、TG和葡萄糖代谢相关酶基因的表达，因此与FFA、TG和葡萄糖代谢有明显关系[9]。研究发现，SREBP-1c基因18号外显子54G/C多态性与法国人的肥胖症及2型糖尿病的发生有关[10-11]。其与NAFLD的关系报道很少。

本研究结果显示，NAFLD组血脂TC、TG和LDL-C水平均明显高于对照组(P<0.05)。本研究中NAFLD组与对照组的SREBP-1c 18号外显子54G/C单核苷酸多态性均以GG型所占比例最高，C等位基因携带者患NAFLD的风险是G等位基因的1.6484倍(OR=1.6484，95%CI：1.3233～10.0984)。研究结果显示，SREBP-1c第54位碱基G同义突变为C(GGG→GGC)，其表达的调节主要在mRNA水平，虽然没有引起第952位的氨基酸甘氨酸(Gly)的变化，但是该突变可能影响SPEBP-1c mRNA 的二级结构及其稳定性[12]，从而导致蛋白质表达发生微小变化，使NAFLD的患病风险增加。

NAFLD组和对照组内基因型的TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均以CC型为高，但除对照组内TG、LDL-C这两项CC基因型明显高于GC、GG型以外(P<0.05)，其他组间CC型与GC、GG型血脂水平的差异无统计学意义(P>0.05)。提示C等位基因可能会使个体的NAFLD发病风险增加。但关于基因型对血脂的影响，鉴于CC型人群数量样本较少，从本次研究中还难以判断基因型的不同是否是NAFLD患者血脂异常的易感因素，需要加大样本量进一步研究。

综上所述，人群的血脂水平异常与NAFLD的患病有显著相关性[13-14]，而参与糖代谢、脂代谢的SREBP-1c基因18号外显子54G/C呈现多态性，其C等位基因可能会使个体的NAFLD发病风险增加。

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Research on correlation between gene polymorphism of sterol regulatory element binding protein 1c and non-alcoholic fatty liver disease

Zhang Haiying1,2,Gao Yanxiang1,Feng Xiaofan2,Zhang Qianyong1,Mi Mantian1

1.Research Center for Nutrition and Food Safety,the Third Military Medical University/Chongqing Key Laboratory of Nutrition and Food Satety,Chongqing 400038,China;2.Chengdu Ommay Health Examination Hospital,Chengdu,Sichuan,610041,China

Objective To study the correlation between gene polymorphism of sterol regulatory element binding protein 1c(SREBP-1c)and non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD).Methods 152 patients with NAFLD and 146 persons without fatty liver were selected as the subjects.Their blood samples were collected,and the blood fat levels were detected.Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)was used to analyze the polymorphism of NO.18 exon 54G/C of SREBP-1c gene.Results The levels of TC,TG,and LDL-C in the NAFLD group were significantly higher than those in the control group(P<0.05).The proportion of GG type was the highest in the mononucleotide polymorphism of SREBP-1c NO.18 exon 54G/C in both groups.There were significant differences in the genotypic frequency between the two groups(χ2=6.1096,P<0.05).The frequency of C allele genotype in NAFLD group was significantly higher than that in the control group(χ2=6.2520,P<0.05).The onset risk degree of NAFLD in the carriers of C allele was 1.6484 times of that in the carriers of G allele(OR=1.6484,95%CI:1.3233-10.0984).Conclusion There is a significant correlation between the abnormal blood fat level and the NAFLD morbidity in the subjects.The No.18 exon 54G/C of SREBP-1c which takes part in the glycometabolism and lipid metabolism presents polymorphism.The C allele may increase the onset risk of NAFLD.

sterol regulatory element binding protein 1c;non-alcoholic fatty liver disease;gene polymorphism;allele

国家自然科学基金资助项目(30972469)

400038 重庆，第三军医大学营养与食品安全研究中心、重庆市营养与食品安全重点实验室(张海英，高燕翔，张乾勇，糜漫天)；成都安生美健康体检医院(张海英，冯晓凡)

张乾勇，电话：023-68752643；E-mail：zqianyong@yahoo.com

R 575.29

A

1004-0188(2014)02-0117-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.02.001

2013-06-03)