TNF-α基因多态性与新疆哈萨克族慢性阻塞性肺疾病易感性的关系

吴水淼，王妨娥，凌 敏，古丽米拉·依马木

(1. 新疆石河子大学医学院，新疆石河子 832002；2. 新疆石河子大学第二附属医院(兵团医院)，新疆乌鲁木齐 830001；3. 新疆自治区人民医院，新疆乌鲁木齐 830001)

◇临床研究◇

TNF-α基因多态性与新疆哈萨克族慢性阻塞性肺疾病易感性的关系

吴水淼1,2，王妨娥1，凌 敏3，古丽米拉·依马木1

(1. 新疆石河子大学医学院，新疆石河子 832002；2. 新疆石河子大学第二附属医院(兵团医院)，新疆乌鲁木齐 830001；3. 新疆自治区人民医院，新疆乌鲁木齐 830001)

目的 探讨新疆哈萨克族慢性阻塞性肺疾病(COPD)与TNF-α基因-308位点(TNF-α-308)多态性的关系。方法 以新疆哈萨克族150例COPD患者和150例健康体检者为研究对象，通过反向测序法对TNF-α-308的基因型进行检测，利用SPSS17软件分析该多态性位点与COPD易感性的关系。结果 在COPD组和对照组中均以GG基因型为主，两组之间的GG、GA和AA基因型分布差异有统计学意义 (P=0.004)，等位基因G和A之间差异亦有统计学意义(P=0.001)；经调整年龄、性别和吸烟史后，分析结果表明A等位基因是COPD发病的危险因素(P=0.001，OR=2.657，95%CI=1.552～4.548)。结论 哈萨克族人群TNF-α-308A等位基因可能是COPD发病的危险因素，携带GA或AA基因型患者发病风险较高。

TNF-α基因；基因多态性；慢性阻塞性肺疾病(COPD)；哈萨克族；新疆；疾病易感性

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是高患病率、高致残率、高病死率的危害人体健康的常见病[1]。其病理基础是气道壁和肺实质的慢性炎症及结构破坏，持续的炎症导致小气道狭窄、肺泡壁损伤、肺结缔组织降解。TNF-α能够促进气道重构，改变平滑肌细胞功能，参与肺部炎症调节，是一个多功能的细胞因子。在COPD患者的痰液及循环血中均检测出TNF-α水平增高，显示其无论在患者的肺局部还是全身炎症反应中都发挥重要作用[2]。

大量临床实验研究表明COPD发病不仅受吸烟等环境因素的影响，也与遗传因素密切相关[3-4]。人类TNF-α基因位于染色体6p21.1-p21.3区域，由4个外显子和3个内含子组成，与HLA基因群密切连锁。研究表明TNF-α基因多态性主要存在于其启动子上游，已发现的多态位点包括-1 196C/T、-1 031T/C、-863C/A、-857C/T、-572A/C、-376G/A、-316G/A、-308G/A、-238G/A、-204T/C和 +489G/A[5]。LOUIS等[6]用脂多糖刺激健康人的全血细胞，发现TNF-α-308G/A突变杂合子的TNF-α产量显著高于GG野生型(P<0.05)，说明在机体发生相同的病理刺激后，TNF-α-308突变影响TNF-α基因的表达量，进而可能影响了COPD的发生和发展。因此，研究热点主要集中于TNF-α-308多态性位点与COPD的相关性。大量研究结果显示，TNF-α-308位点与亚洲人群COPD发病相关，而在白种人中与COPD发病无相关性，表明TNF-α基因-308位点在COPD的发病中所发挥的作用在不同种族之间有差异。

新疆哈萨克族人群至今仍保留有大量相对完整的隔离遗传体系。高血压和肥胖这些由遗传和环境相互作用所致的复杂疾病在新疆哈萨克族人群中存在聚集高发的现象，提示在该民族中蕴含着珍贵的遗传资源，因而哈萨克族人群是进行复杂疾病如COPD的分子流行病学研究的理想人群。但是，目前为止尚没有关于哈萨克族TNF-α-308多态性位点与COPD相关性的研究报道，为此本研究开展了TNF-α-308多态性位点与新疆哈萨克族COPD易感性的相关性研究，为探索COPD的发病机理提供实验数据；并分析该基因的多态性在不同种族间分布存在着差异，为今后开展类似研究提供基础数据。

1 对象与方法

所有受试者均来自2009年在新疆乌鲁木齐县芦草沟乡及沙湾县牛圈子农场COPD现况调查哈萨克族人群，COPD组：150例，符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》标准[1]；对照组：150例，肺功能符合以下指标：第一秒用力呼气容积/用力肺活量(FEV1/FVC)>70%)，FEV1≥80%预计值。两组均除外慢性支气管炎、支气管哮喘、肺结核、呼吸系统肿瘤及高血压、糖尿病、冠心病等具有遗传倾向的疾病。调查研究对象的年龄、性别、吸烟史、临床症状及体征，进行全套肺功能检查。两组对象均为无民族间遗传干扰(与其他民族人无通婚情况)、无血缘关系的哈萨克族，所有受试者均签署书面的志愿书，该研究经本单位的伦理委员会批准。

1.2 标本采集 在清晨空腹时采集研究对象的静脉血2 mL，EDTA抗凝，将抗凝管上下轻轻颠倒8～10次，使血液与抗凝剂充分混合，-20 ℃低温保存。

1.3 基因组DNA提取及PCR扩增 应用全血基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)，按厂家提供的说明书方法提取全血基因组DNA。提取的DNA置于-20 ℃保存备用。参照SAKAO等[7]设计的引物，上游引物：5′-AGGCAATAGGTTTTGAGGGC-CAT-3′，下游引物：5′-GAGCGTCTGCTGGCTGGGTG-3′。引物由北京鼎国生物工程公司合成。采用35 μL PCR反应体系：10 mmol/L dNTP混合物2 μL，10×TaqBuffer 3.5 μL，2 UTaqDNA聚合酶，10 μmol/L上下游引物各1 μL，超纯水补足至35 μL。所用试剂均购置于北京鼎国生物工程公司。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，63 ℃退火40 s以及72 ℃延伸60 s，共35个循环；然后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，判定PCR产物扩增出目的条带的质量。

1.4 测序 PCR产物经纯化后由北京鼎国生物工程公司进行反向测序，根据测序结果判定3种基因型：AA型、AG型和GG型。测定结果出现双峰，即为该位点的杂合子型，出现单峰则为纯合子型。

1.5 统计分析 直接计数法计算等位基因及基因型频率；采用SPSS 17.0软件统计分析，研究对象与基因遗传平衡规律(Hardy-Weinberg平衡)的符合程度采用χ2检验分析；计量资料以均数±标准差表示，计数资料比较采用χ2检验，多因素调整采用Logistic回归分析，计算比值比(oddsratios,OR)和95%可信区间 (confidence intervals,CI)用来检测TNF-α-308位点多态性和COPD的关系。所有统计均为双侧，显著性检验水准取α=0.05。

2 结 果

2.1 COPD组与对照组的一般资料 本研究共纳入150例COPD患者和150例对照。在性别(男∶女比例=137∶13和140∶10)和年龄[平均年龄(61.9±6.7)、(60.5±5.9)岁]方面病例组和对照组之间差异无统计学意义，两组间吸烟指数差异无统计学意义(P=0.088，表1)。

表1 新疆哈萨克族COPD组与对照组的一般资料

Tab.1 The general data of COPD patients and controls in Xinjiang Kazakh population

组别年龄(岁)性别男女吸烟史(例)有无吸烟指数(包/年)FEV1预计值FEV1/FVCCOPD组61.9±6.7137131262431.0±17.160.4±11.156.5±8.3对照组60.5±5.9140101143627.8±14.790.7±5.785.5±6.1统计量1.92*0.42#3.00#1.71*29.72*34.35*P值0.0560.560.0830.0880.0000.000

*为t值，#为χ2值。

2.2 TNF-α-308位点各基因型及等位基因频率分布 TNF-α基因片段采用反向测序法进行检测，通过测序图可区分出3种基因型GG、GA和AA(图1)。

图1 新疆哈萨克族人群中的TNF-α-308位点的测序结果

Fig.1 Result of TNF-α-308 sequence in Xinjiang Kazakh populationA：TNF-α-308位点野生纯合型(GG型)；B：TNF-α-308位点突变杂合型(GA型)；C：TNF-α-308位点突变纯合型(AA型)。

COPD组与对照组个体间GG、GA和AA基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，表明其基因频率处于遗传平衡状态，具有群体代表性。3种基因型频率经χ2检验显示两组人群间差异有统计学意义(χ2=11.06，P=0.004)，两等位基因分布差异亦有统计学意义(χ2=13.44，P=0.001，表2)。

表2 哈萨克族人群中 TNF-α-308位点的基因型和等位基因的分布

Tab.2 The distribution of TNF-α-308 genotypes and allele in Kazakh population [n(%)]

2.3 TNF-α-308位点的基因型及等位基因与COPD易感性的关系 以研究对象是否患COPD为因变量，经Logistic回归分析(协变量包括年龄、性别、吸烟史、GG、GA、AA基因型)，经调整年龄、性别和吸烟史后，COPD组A等位基因频率(16.7%)高于对照组(7.0%)，可能与COPD的发病风险有关(OR=2.657，95%CI=1.552～4.548)，差异有统计学意义(P=0.001，表3)。

表3 哈萨克族人群中TNF-α-308位点基因型及等位基因与COPD易感性的关系

Tab.3 Relationship of TNF- α -308 genotypes and alleles with susceptibility to COPD in Kazakh population [n(%)]

变量COPD组(n=150)对照组(n=150)POR值95%CI基因型 GG109(72.7)131(87.3)1 GA32(21.3)12(8.0)0.0130.4420.233～0.839 AA 9(6.0) 7(4.7)0.0330.1850.039～0.874等位基因 A50(16.7)21(7.0)1 G250(83.3)279(93.0)0.0012.6571.552～4.548

3 讨 论

COPD不但受环境影响，机体内多个基因同时也共同参与了病程的发生与发展。TNF-α能促进气道重构，改变平滑肌细胞功能，参与肺部炎症调节，是参与COPD发病的重要基因。由于TNF-α基因启动子区-308位点G/A突变能显著影响TNF-α基因的表达水平，提示TNF-α-308多态性在COPD的发病过程中起重要作用。目前，关于TNF-α-308多态性与COPD相关性的研究中，不同种族的分析结果并不一致，有必要继续对其他种族TNF-α-308多态性与COPD的关系进行研究，以确定其在COPD发生和发展中的作用。新疆哈萨克族人群至今仍保留有相对完整的隔离遗传体系，是进行复杂疾病分子流行病学研究的理想人群。因此，本研究以哈萨克族人群为研究对象，分析COPD与哈萨克族TNF-α-308多态性的相关性。本研究结果显示在哈萨克族人群COPD组和对照组中，TNF-α-308位点均以GG基因型多见，COPD组GA基因型和A等位基因的频率均高于对照组，且两组间差异有统计学意义(P<0.05)。A等位基因可能是COPD的危险因素，携带GA和AA基因型患者发病风险较高，提示TNF-α-308多态性与新疆哈萨克族COPD易感性有关。

本研究结果与SAKAO等[7]和HUANG等[8]在日本人群和台湾人群中的研究结果一致，均表明TNF-α-308A等位基因频率在COPD组和健康对照组的差异有统计学意义，也与翟芳芝等[4]在汉族人群中的研究结果相似。但HIGHAM等[9]和龚燕等[10]分析认为英国人群和北方汉族人群中TNF-α-308位点的多态性与COPD的易感性无关。MELEK等[11]在对土耳其人群的研究中也发现，TNF-α-308位点A等位基因不是COPD的危险因素。说明TNF-α-308位点在不同人群中的作用机制或对COPD的影响有所不同，可能与人种、民族或地域等差异有关。本研究进一步比较了不同人种中TNF-α-308A基因的分布频率，发现TNF-α-308A等位基因在亚洲人群中的分布频率为5%～14%[4]，而在白种人群中的分布频率为8%～27%[12-13]，这种差异可能是COPD在不同种族、不同区域间发病率和临床特点存在差异的原因之一。

本研究哈萨克族TNF-α-308分布频率的实验数据可以为进一步研究哈萨克族人群中COPD的发病机制积累了资料和数据，也为研究哈萨克族人群中与TNF-α基因多态性相关的其他疾病提供了基础。

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(编辑 国 荣)

Relationship between tumor necrosis factor-α gene promoter polymorphismand susceptibility to development of COPD in Xinjiang Kazakh population

WU Shui-miao1,2, WANG Fang-e1, LING Min3, GU LI-MI LA Yimaer1

(1. Medical College, Shihezi University, Shihezi 832002; 2. the Second AffiliatedHospital of Shihezi University (the Corps Hospital), Urumqi 830001; 3. Department ofRespiratory Medicine, People’s Hospital of Xinjiang, Urumqi 830001, China)

Objective To investigate the relationship between chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and polymorphism of tumor necrosis factor-α gene-308 promoter in Xinjiang Kazakh population. Methods PCR product sequencing method was used to detect the polymorphism of TNF-α gene in 150 COPD patients and 150 healthy controls in Xinjiang Kazakh population. The relationship between the polymorphism sequence and susceptibility to COPD was analyzed by SPSS17.0 software. Results The distribution of genotypes GG, GA and AA was significantly different between COPD and control groups (P=0.004), with genotype GG being dominating. After adjustment for sex, age and smoking history, the A allele was a risk factor for COPD (P=0.001,OR=2.657, 95%CI=1.552-4.548). Conclusion TNF-α A allele frequency may be a risk factor of COPD in Xinjiang Kazakh population and patients carrying genotype GA or AA have a higher risk of COPD.

TNF-α gene; polymorphism; chronic obstructive pulmonary disease (COPD); Kazakh population; Xinjiang; susceptibility to disease

2013-10-17

2014-2-21

中华医学会慢性呼吸道疾病专项基金资助项目(No.07010160024) Supported by the Chinese Medical Association Special Fund for Chronic Respiratory Diseases (No.07010160024)

凌敏，主任医师，硕士生导师. E-mail: lingmin1121@163.com

吴水淼(1981-)，男(汉族)，硕士，主治医师. 研究方向：呼吸系统疾病. E-mail: wushuimiao0102@sohu.com；并列第一作者，王妨娥(1988-)，女(汉族)，在读研究生，研究方向：呼吸系统疾病. E-mail: fangemeimei@126.com

时间：2014-07-21 17∶52 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140721.1752.001.html

R563.9

A

10.7652/jdyxb201406018