大鼠弥漫性轴索损伤后海马区caveolin-1的表达及其与星形胶质细胞活化的关系

赵永林，宋锦宁，马旭东，张斌飞，张 明，李丹东，庞宏刚，罗显华

(西安交通大学医学院第一附属医院神经外科，陕西西安 710061)

◇专题研究◇

大鼠弥漫性轴索损伤后海马区caveolin-1的表达及其与星形胶质细胞活化的关系

赵永林，宋锦宁，马旭东，张斌飞，张 明，李丹东，庞宏刚，罗显华

(西安交通大学医学院第一附属医院神经外科，陕西西安 710061)

目的 研究大鼠弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury, DAI)后小窝蛋白1(caveolin-1)在大鼠脑海马区的表达，探讨caveolin-1的表达变化与星形胶质细胞活化的关系。方法 运用Western blot检测大鼠海马中caveolin-1的表达，运用免疫组化检测海马区胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，并通过免疫荧光共定位分析caveolin-1与GFAP之间的相互作用。结果 Western blot结果提示DAI后海马区caveolin-1的表达从1 d开始显著降低，并持续降低至7 d(P<0.05)；免疫组化结果提示DAI后星形胶质细胞活化标志物GFAP的表达从1 d后逐渐升高，3 d后达峰，7 d后稍降低，但仍高于正常(P<0.05)；免疫荧光共定位提示DAI后caveolin-1与GFAP的共定位细胞数随着时间的延长逐渐增加。结论 大鼠DAI后海马区caveolin-1的表达减少，GFAP的表达增加，星形胶质细胞内caveolin-1的表达变化可能是导致GFAP升高及星形胶质细胞活化的机制之一。

弥漫性轴索损伤；小窝蛋白1；星形胶质细胞活化；海马；大鼠

弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury, DAI)后星形胶质细胞出现反应性活化，其活化包括生物分子表达、进行性的细胞肥大、增生和瘢痕形成等，且随着病损的性质和严重程度呈现连续的、有梯度的和进行性的改变，这些改变的性质和程度是由特定的分子信号级联调控的，可能使星形胶质细胞失去部分功能，同时获得一些新功能，继而对周围的神经细胞和非神经细胞产生正面效应和负面效应[1-2]。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)是星形胶质细胞活化的标志物，尽管研究者对星形胶质细胞活化尤其是GFAP的表达增加有深入的研究，但具体机制仍不明确[3]。小窝(caveolae)是细胞质膜内陷所形成的特化的囊状结构，主要由蛋白质和脂类组成。小窝蛋白-1(caveolin-1)是小窝的主要结构和调节成分，参与胆固醇平衡、分子运输和跨膜信号发生。caveolin-1能与多种关键性信号分子如G蛋白α亚单位、Ha-Ras、酪氨酸激酶家族成员(Src、Fyn等)、EGF受体、胰岛素受体、PKC和eNOS等连接，对信号分子的活性状态起直接调控作用，尤其是负性调控作用，从而参与细胞的生长、发育和增殖、炎症、衰老等多种病理生理过程[4-5]。由于caveolin-1在DAI后星形胶质细胞活化中的作用尚不明确，本研究采用头颅瞬间旋转损伤装置建立大鼠DAI模型观察DAI后海马组织caveolin-1的变化趋势，探讨caveolin-1在星形胶质细胞活化中的作用，以揭示DAI后星形胶质细胞活化的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂仪器 相同遗传背景的健康成年雄性SD大鼠60只，体质量250～300 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，许可证号SCXK(陕)08-018，该实验伦理经西安交通大学医学部生物医学伦理委员会批准。细胞膜蛋白提取试剂盒(Thermo Scientific，美国)；caveolin-1兔单克隆抗体(Abcam，美国)；GFAP鼠单克隆抗体(Santa Cruz，美国)；辣根过氧化物酶标记的IgG二抗(Santa Cruz，美国)；FITC、CY3标记的羊抗兔/鼠荧光二抗(博奥森，中国)；PVDF膜(Millipore，美国)；凝胶成像系统(JS-380A，中国)；图像采集与分析系统(Leica-Q550CW，德国)；荧光显微镜(OLYMPUS，日本)；SPSS16.0统计软件(美国)。

1.2 实验动物分组 选取健康成年雄性SD大鼠，随机分为正常组、假手术组和模型组，正常组及假手术组各12只，模型组又分为伤后1、3、7 d三个亚组,每亚组12只。

1.3 大鼠DAI模型的建立 采用刘晓斌等[6]研制的大鼠头颅瞬间旋转损伤装置制备大鼠DAI模型：各组大鼠经100 g/L水合氯醛麻醉(0.2～0.3 mL/100 g)后，固定于旋转装置上。模型组大鼠苏醒后出现较剧烈挣扎，在挣扎间歇期，按动扳机，致其头颅瞬间旋转90°，重复8次。假手术组大鼠苏醒后即从装置上卸下。模型组在预定时间、正常组在观察6 h后，用100 g/L水合氯醛腹腔麻醉，快速开胸，左心室插管至主动脉，灌注9 g/L生理盐水至流出液清亮后，换40 g/L多聚甲醛溶液灌注，灌注完成后迅速取脑。

1.4 大鼠神经行为学评分 各组大鼠于术后1 d、3 d及7 d按改良神经功能缺失程度评分表(modified neurological severity score, mNSS)评估大鼠神经功能缺损。mNSS包括运动、感觉、平衡、反射等检测，总分为18分，得分越高，脑损伤程度越重[7-8]。

1.5 HE染色 各组大鼠于预定时间点灌注生理盐水及40 g/L多聚甲醛后取脑，标本置于多聚甲醛溶液中继续固定48 h。常规石蜡包埋，每个蜡块连续切片厚4 μm，脱蜡、梯度乙醇水化后染色：将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色，酸水及氨水中分色，流水冲洗1 h后入蒸馏水，入700 mL/L和900 mL/L乙醇脱水，入乙醇伊红染色液染色，染色后的切片常规脱水、透明、封片，于Leica-Q550CW图像采集与分析系统上采集、分析图片。

1.6 免疫组织化学法检测 取石蜡切片，脱蜡如前，高压修复抗原。山羊血清室温封闭30 min后，滴加鼠单克隆抗GFAP抗体(1∶200)，4 ℃过夜。生物素化二抗37 ℃孵育30 min后，辣根酶标记链霉卵白素37 ℃孵育30 min。DAB显色、苏木素溶液复染，脱水、封片。光镜下观察，Leica-Q550CW图像分析系统采集图像。每张切片随机选取6个视野(×200)，Image-Pro Plus 6.0对GFAP进行免疫组化半定量分析。

1.7 免疫荧光染色 取石蜡切片，脱蜡、抗原修复如前。滴加PBS稀释过的正常山羊血清封闭液，室温封闭20 min。滴加兔多克隆抗caveolin-1(1∶100)，鼠单克隆抗GFAP(1∶100)，4 ℃过夜，PBS洗片3次，每次5 min。滴加FITC、CY3标记的抗兔/鼠荧光二抗(1∶100)，室温避光孵育2 h，PBS洗片3次，每次5 min。甘油缓冲液封片，于荧光显微镜下观察结果并拍照。用photoshop cs5对荧光照片进行合成。

1.8 Western blot检测蛋白表达 各组大鼠于预定时间点灌注取脑，取海马，加入裂解液制成组织匀浆，用Bio-Rad试剂盒测定蛋白含量，蛋白煮沸变性后取50 μg蛋白样品，用SDS-PAGE电泳半干法转移至PVDF膜，将膜放入50 g/L脱脂牛奶中，37 ℃封闭2 h，加入一抗caveolin-1(1∶1 000)，β-actin(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜，将膜与辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG(1∶5 000)和抗鼠IgG(1∶5 000)室温孵育1 h，洗膜3次，用增强化学发光法观察显影，凝胶成像系统拍照，Quantity One 4.6软件作定量分析。

2 结 果

2.1 DAI后组织病理学的改变 HE染色观察：假手术组皮层及海马神经元形态结构完整，胶质细胞分布正常；DAI后1 d皮层及海马神经元肿胀，体积增大，核膜不清，核仁深染、偏位或消失，核固缩，仅显示细胞核轮廓或无细胞核，胞质和胞核黏附，深染的固缩神经元数目明显增多，神经细胞周围出现空隙(图1)。

图1 假手术组与DAI组脑皮质及海马组织的形态学改变

Fig.1 Microscopic observation of the brain cross-sections of control rats and rats subjected to DAI (HE,×400)

A：假手术组海马；B：假手术组皮层；C：DAI后24 h海马；D：DAI后24 h皮层。

2.2 大鼠神经行为学评分 DAI模型组在建模后均出现不同程度的昏迷，持续时间1～30 min不等，之后表现出不同程度的运动、感觉、平衡、反射等方面的神经功能缺损。DAI组均有明显神经功能缺损，mNSS评分显示大鼠建模后1 d神经功能缺损最为严重，3～7 d逐渐好转。各组数据方差分析显示各时间点组间差异具有统计学意义(F=52.88，P=0.005，表1)。

表1 各组大鼠mNSS神经功能评分的比较

Tab.1 The neurological scores of rats in different groups

组别例数1d评分3d评分7d评分假手术组60.00±0.000.00±0.000.00±0.00DAI组66.17±1.33*5.33±1.03*4.17±0.75*

与假手术组比较，*P<0.05。

2.3 DAI后大鼠海马区caveolin-1的动态表达 DAI组各时间点海马caveolin-1蛋白的表达均低于正常和假手术组(P<0.05)，并且伤后随着时间的延长，caveolin-1蛋白的表达逐渐减少，方差分析显示caveolin-1表达在各组间比较差异有统计学意义(F=90.21,P=0.001，图2)。

图2 DAI后不同时间点caveolin-1的表达及灰度分析

Fig.2 The expression and gray value of caveolin-1 in rats after DAI

DAI组与正常组、假手术组比较，*P<0.05；每组n=6。

2.4 DAI后大鼠海马区GFAP的表达 正常组及假手术组的海马区均有少量GFAP表达。伤后1 d星形胶质细胞星状突起纤细，GFAP分布于胞质及星状突起中；伤后3 d GFAP增生活跃，星形胶质细胞外形肥大，突起粗大不规则；7 d后GFAP增生较前减少，外形仍肥大。DAI组海马GFAP蛋白的表达均高于正常和假手术组(P<0.05)，DAI后3 d GFAP的表达较1 d明显升高(P<0.05)，到了伤后7 d，GFAP的表达较3 d降低，但仍比1 d组、正常组及假手术组高(P<0.05)。方差分析显示GFAP表达在各组间比较差异有统计学意义(F=313.91,P=0.000，图3)。

图3 DAI后脑组织中GFAP的表达Fig.3TheexpressionofGFAPinthehippocampusofratsafterDAI(ICH,×200)A:正常组;B:假手术组;C～E:DAI后1、3、7d组。DAI组与正常组、假手术组比较,*P<0.05;每组n=6。

2.5 DAI后大鼠海马区caveolin-1与GFAP的免疫荧光显色及二者的共定位分析 在假手术组大鼠的海马区，caveolin-1表达丰富，GFAP的表达较少。DAI后，海马区的caveolin-1较正常减少，GFAP较正常增加，caveolin-1与GFAP出现共定位的细胞数量随着时间的延长逐渐增加，7 d最多(图4)。

3 讨 论

DAI后胼胝体、白质、内囊及丘脑等处的神经元轴突存在肿胀等病理改变，受损伤的轴突分散在正常的轴突之间，为阐明DAI的病理机制，人们制作了各种动物模型，期望能模拟DAI的病理过程[9-10]。目前，关于DAI的模型主要有横断损伤模型、打击负荷模型、液压损伤模型、加速/减速损伤模型、牵拉损伤模型、瞬间旋转损伤模型等[11]。本实验采用的是大鼠头颅瞬间旋转损伤模型，是DAI研究中应用最广泛、代表性最强的模型。该模型能使脑内产生剪应力，比其他模型更符合DAI的发生机制。本实验通过HE染色对伤后1 d大鼠的皮层及海马形态观察发现：DAI后神经元肿胀，核固缩，深染的固缩神经元数目明显增多，神经细胞周围出现空隙；并且大鼠mNSS评分在伤后1 d最高，随后降低。结合组织学和神经行为学评分，本模型能很好的模拟DAI后的病理改变[12]。

脑外伤后星形胶质细胞的形态、蛋白的表达和细胞因子的释放均发生变化，这种以增殖、细胞体和核过度肿大为特征，持续存在于任何受损部位的特异性病理过程称为星形胶质细胞活化。GFAP是星形胶质细胞的特异性标志蛋白，广泛的生理生化损伤和严重的病理刺激均可使星形胶质细胞合成GFAP，这种神经胶质合成活跃的过程是星形胶质细胞对脑内任何严重损害的一种特有反应[13]。在活性胶质细胞的发展中，GFAP的表达增加，最后成为胶质疤痕的主要成分[14-15]。NEARY等[16]对多种颅脑损伤进行观察后发现，伤后早期GFAP分布于胞质及星状突起中，星形胶质细胞的星状突起纤细，伤后2 d GFAP星形胶质细胞增生活跃，数量增多，外形肥大，突起粗大；2 d 后星形胶质细胞数量明显增多，胞体变大，突起粗大不规则，GFAP染色进一步加深。本实验的结果显示正常及假手术组的海马区均有少量GFAP的表达，DAI后1 d，GFAP表达升高，3 d更高，7 d后降低，与既往研究结果相同[17]。

Caveolae是细胞质膜上存在的一些小凹点、小囊泡，属于亚显微结构，直径约50～100 nm，富含神经绿色荧光代表caveolin-1，红色荧光代表GFAP，二者merge后重叠部分为黄色(白色箭头所示)；每组n=6。

图4 大鼠弥漫性轴索损伤后不同时间点caveolin-1和GFAP的免疫荧光双标染色

Fig.4 The expression and co-localization of caveolin-1 and GFAP in rats after DAI were evaluated by immunofluorescence staining at different time points (×200)

鞘磷脂、鞘糖脂、胆固醇以及各种蛋白质分子。Caveolae参与胞吞和胞内外运输，细胞的分化、增殖、死亡和迁移，重塑细胞外环境，细胞的信号转导等多种病理生理过程[4,18-19]。Caveolin-1是caveolae的标志蛋白，也是信号转导的主要调节者，它可通过其脚手架域与信号分子直接接触作用，调节它们的功能状态，如eNOS，而对一些信号蛋白则与其受体结合来调节信号转导[5]。在不同的病理生理过程中，caveolin-1呈现出不同的改变，既有caveolin-1的增加或减少，也有的caveolae形态改变[20]。本研究观察了大鼠DAI后海马组织内caveolin-1的表达变化，结果显示随着受伤时间的延长，caveolin-1的表达逐渐降低。

Caveolin-1在不同疾病模型中均参与了星形胶质细胞活化。在局灶性脑缺血模型中，caveolin-1缺失的小鼠较野生型小鼠表现出更强的星形胶质细胞活化，这可能是其加重脑损伤的机制之一[21]。大鼠脊髓经γ射线照射后，caveolin-1与GFAP的表达均增加，且二者之间共定位程度也增加，表明活化的星形胶质细胞内caveolin-1的表达增加，提示caveolin-1可能参与了γ射线导致的星形胶质细胞活化[22]。脑外伤后，辛伐他汀可以通过调控caveolin-1抑制GFAP的表达，也提示caveolin-1可能是GFAP的调控靶点之一[23]。本研究结果表明：DAI后大鼠海马区caveolin-1的表达降低，其表达变化可能参与DAI后的病理生理过程。在正常海马中，caveolin-1与GFAP几乎不存在共定位，提示星形胶质细胞中caveolin-1的表达较少；DAI后，caveolin-1与GFAP的共定位程度明显增加，提示GFAP阳性的星形胶质细胞内caveolin-1的表达增加，星形胶质细胞内GFAP与caveolin-1的表达呈正相关，增生的caveolin-1可能参与 GFAP及星形胶质细胞形态改变的调控。Caveolin-1参与GFAP表达及星形胶质细胞活化的具体机制仍需进一步研究。

综上所述，DAI可导致大鼠海马区caveolin-1的表达降低，星形胶质细胞内caveolin-1的表达变化可能是导致GFAP升高及星形胶质细胞活化的机制之一。

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(编辑 韩维栋)

Changes of caveolin-1 expression in the hippocampus of rats afterdiffuse axonal injury and its relationship with activation of astroglia

ZHAO Yong-lin, SONG Jin-ning, MA Xu-dong, ZHANG Bin-fei,ZHANG Ming, LI Dan-dong, PANG Hong-gang, LUO Xian-hua

(Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital, Medical School ofXi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

Objective To explore the dynamic expression of caveolin-1 in rat hippocampus after diffuse axonal injury (DAI) and its role in activation of astroglia. Methods Western blot was used to determine the expression of caveolin-1 in the hippocampus after DAI; immunohistochemistry staining was used to determine the dynamic expression of GFAP in the hippocampus of rats after DAI. The expression and co-localization of caveolin-1 and GFAP in rats after DAI were evaluated by immunofluorescence staining at different time points. Results The expression of caveolin-1 significantly decreased after DAI, and continued to decline from day 1 to day 7 (P<0.05). Immunohistochemistry staining indicated that GFAP-positive cells significantly increased from day 1 to day 3, and slightly decreased at day 7 (P<0.05). The co-localization of caveolin-1 and GFAP revealed that the number of both caveolin-1- and GFAP-positive cells gradually increased. Conclusion Caveolin-1 expression significantly decreased with the increase of GFAP expression in the hippocampus of rats after DAI. Caveolin-1 may be involved in the dynamic expression of GFAP and play an important role in the activation of astroglia after DAI.

diffuse axonal injury; caveolin-1; activation of astroglia; hippocampus; rat

2014-04-21

2014-06-27

国家自然科学基金资助项目(No.30471774)；教育部新世纪优秀人才支持计划资助项目(No.NCET-05-0831)；陕西省自然科学基金资助项目(No.2003C1-16) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30471774), the New-Century Excellent Talents Program of Ministry of Education (No.NCET-05-0831) and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2003C1-16)

宋锦宁，博士，教授，主任医师，博士生导师. E-mail：jinnings@126.com

赵永林(1987-)，男(汉族)，博士研究生在读. 研究方向：脑血管病、脑外伤基础及临床. E-mail: zhaoyonglinlin@163.com

时间：2014-09-19 09∶27 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140919.0927.002.html

R651.1

A

10.7652/jdyxb201406005