中介素抑制高肺血流性肺动脉高压大鼠肺组织胶原生成*

庞璐璐， 齐建光， 高 扬， 金红芳， 杜军保

(北京大学第一医院儿科，北京 100034)

中介素抑制高肺血流性肺动脉高压大鼠肺组织胶原生成*

庞璐璐， 齐建光△， 高 扬， 金红芳， 杜军保

(北京大学第一医院儿科，北京 100034)

目的： 研究中介素(IMD)对高肺血流性肺动脉高压大鼠肺组织胶原生成和沉积的调节作用及其机制。方法: 健康雄性SD大鼠20只，随机分为对照组(n=7)、分流组(n=7)和分流+IMD组(n=6)。对后2组大鼠行腹主动脉-下腔静脉分流术。8周后，对分流+IMD组大鼠，皮下埋微量渗透泵持续给予IMD 1.5 μg·kg-1·h-1。继续饲养2周后，比较各组大鼠肺动脉平均压(mPAP)、肺中、小动脉相对中膜厚度(RMT)，肺组织羟脯氨酸、Ⅰ和Ⅲ 型胶原、骨形成蛋白-2(BMP-2)含量和I、III型前胶原mRNA表达水平。结果: 与对照组相比，分流组大鼠mPAP明显上升，肺中、小动脉RMT明显增加，肺组织羟脯氨酸和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显增多，Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达上调，BMP-2含量明显增多。IMD则使分流大鼠肺动脉压力明显回降，肺血管结构改变缓解，胶原沉积减少，BMP-2含量降低，Ⅰ、Ⅲ 型前胶原mRNA表达下调。结论: IMD可通过抑制高肺血流大鼠肺组织胶原生成和沉积，缓解高肺血流性肺动脉高压和肺血管结构重构形成，该作用可能与BMP-2途径有关。

肺动脉高压; 高肺血流; 胶原; 中介素

中介素(intermedin, IMD)是近年来发现的一种心血管保护性多肽，参与了多种心血管疾病的发生发展过程。既往研究显示，IMD可呈剂量依赖性地舒张肺血管，降低肺动脉压力[1]。我们新近的研究表明，外源性应用IMD可缓解高肺血流大鼠肺动脉高压和肺血管结构重构的形成[2]。胶原构成细胞外基质的框架，以胶原沉积为主要特征的肺血管基质重塑是高肺血流性肺血管结构重构的重要组成部分[3]。IMD是否可通过干预肺组织胶原合成和沉积从而调节高肺血流性血管结构重构和肺动脉高压的形成，目前尚不清楚。本研究通过观察长期应用IMD对高肺血流大鼠肺组织胶原合成和沉积的影响及机制，探讨IMD对高肺血流性肺动脉高压和肺血管结构重构的作用机制。

材 料 和 方 法

1 动物

清洁级雄性SD大鼠20只，体重160g±10 g，购自军事医学科学院(SCXK-2007-004)。

2 主要仪器和试剂

微量渗透泵2002型购自ALZE；中介素购自Phoenix；引物和探针由上海生工生物工程有限公司合成；大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒购自武汉伊艾博科技有限公司；羟脯氨酸试剂盒和大鼠骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2) ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

3 主要方法

3.1 动物模型的制备及给药 将20只SD大鼠随机分为3组：对照(control)组(n=7)，分流(shunt)组(n=7)和分流+IMD(shunt+IMD)组(n=6)。分流组和分流+IMD 组大鼠行腹主动脉-下腔静脉分流术[4]。大鼠腹腔注射10%水合氯醛3～4 mL/kg麻醉后，取仰卧位固定于手术台上。腹部正中切口，沿腹主动脉左侧壁分开后腹膜，显露腹主动脉及下腔静脉，用哈巴狗钳于左肾动脉起始部下方将腹主动脉夹闭。以腹主动脉的左肾动脉起始部至其末端段的下2/3处之左侧壁为穿刺点，用12号一次性针头以45°角穿透腹主动脉壁进入相邻的下腔静脉内，撤出针头，再用9-0号线缝合腹主动脉壁的穿刺口。之后移开哈巴狗钳，若观察到下腔静脉颜色由暗变红，血流有波动，证实分流手术成功。用4号丝线分别连续缝合腹膜、肌层和皮肤。对照组仅开腹暴露腹主动脉及下腔静脉，不做分流术。大鼠饲养8周后，对分流+IMD组大鼠，于背部皮下做一长约1 cm切口，埋置微量渗透泵，持续皮下给药2周，剂量为1.5 μg·kg-1·h-1。各组大鼠饲养条件相同。

3.2 肺动脉压力的测定 于实验10周后(第70天)以右心导管法测定肺动脉压力[5]。大鼠腹腔注射10%水合氯醛3～4 mL/kg麻醉。分离大鼠右侧颈外静脉，将聚乙烯导管一端插入右侧颈外静脉，经上腔静脉、右心房、右心室进入肺动脉，另一端经压力传感器与多导生理记录仪(成都泰盟科技有限公司)相连，描记肺动脉压力曲线，记录肺动脉平均压(mean pulmonary artery pressure, mPAP)。

3.3 肺中、小动脉相对中膜厚度的观测 大鼠开胸取相同部位肺叶固定于4%多聚甲醛中，乙醇脱水，二甲苯透明后石蜡包埋，切片。以醛复红染色弹力纤维。光镜下观察切片的肺肌型动脉(在光镜下具有完整的内外两层弹力层)。应用CMIAS 图像处理与分析系统(Leica)计算肺中、小肌型动脉的相对中膜厚度(relative medial thickness, RMT)，每只大鼠测量6～10个肺中型(外径50～150 μm)和小型(15～50 μm)肌型动脉的RMT，然后求其均值作为该大鼠的RMT值[6]。

3.4 肺组织羟脯氨酸和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量的测定 称取肺组织，加入10倍体积的缓冲液，匀浆后采用南京建成羟脯氨酸含量的测定试剂盒测定肺组织羟脯氨酸含量，操作严格按说明书进行。

ELISA法测定肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原含量，操作严格按说明书进行。

3.5 肺组织Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达水平的测定 Trizol法提取大鼠肺组织总RNA，逆转录为cDNA。用real-time PCR法检测大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达水平。PCR反应体系为25 μL(cDNA 1 μL, 2.5 mmol/L dNTP 1 μL，5 pmol/L TaqMan探针1 μl，ROX 0.5 μL，7.5 pmol/L上、下游引物混合物1 μL，10× PCR 缓冲液2.5 μL以及DNA聚合酶0.25 μL)。用β-actin为内参照校正Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达水平。引物和探针序列见表1。

3.6 肺组织BMP-2含量的测定 ELISA法测定肺组织BMP-2含量，操作严格按说明书进行。

4 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 16.0统计软件分析，均数间比较采用单因素方差分析，2组之间的比较采用LSD检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 引物和探针序列

FAM: 5-carboxyfluorescein; TAMRA: 5-carboxytetramethylrhodamine.

结 果

1 IMD降低肺动脉平均压

分流组大鼠mPAP显著升高(P<0.01)，IMD则使分流大鼠mPAP明显降低(P<0.01)，见表2。

2 IMD降低肺中、小动脉相对中膜厚度

与对照组相比，分流组大鼠肺中、小肌型动脉RMT明显升高(P<0.01)，IMD则使分流大鼠肺中、小肌型动脉RMT明显降低(P<0.05),见表2。

表2 大鼠血流动力学及形态学指标

mPAP: mean pulmonary artery pressure; PA: pulmonary artery；**P<0.01vscontrol group;△P<0.05,△△P<0.01vsshunt group.

3 IMD减轻肺组织胶原沉积

与对照组相比，分流组大鼠肺组织匀浆羟脯氨酸和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显升高(P<0.01)。IMD则使分流大鼠肺组织匀浆羟脯氨酸和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显降低(P<0.01)，见表3。

4 IMD减少肺组织前胶原合成

与对照组相比，分流组大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型前胶原 mRNA水平明显升高(P<0.05)。IMD则使分流大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA水平明显降低(P<0.05)，见图1。

5 IMD降低肺组织BMP-2含量

与对照组相比，分流组大鼠肺组织BMP-2明显升高(P<0.01)。IMD则使分流大鼠肺组织BMP-2含量明显降低(P<0.05)，见表3。

表3 肺组织羟脯氨酸、Ⅰ、Ⅲ 型胶原及BMP-2含量

BMP-2: bone morphogenetic protein-2.**P<0.01vscontrol group;△P<0.05,△△P<0.01vsshunt group.

Figure 1.The expression of procollagen Ⅰ (A) and Ⅲ(B) mRNA in the lung of rats. Mean±SD.n=6～7.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;△P<0.05,△△P<0.01vsshunt group.

图1 肺组织I、III型前胶原mRNA的表达

讨 论

肺血管结构重构是高肺血流性肺动脉高压发生的重要病理生理基础[7]，其主要特征是肺血管内皮细胞和平滑肌细胞异常增殖，细胞外基质重塑，血栓和纤维化形成。肺血管结构重构和肺动脉高压的程度是影响先天性心脏病治疗时机和预后的重要因素[8]。目前关于高肺血流性肺血管结构重构的形成机制尚不完全清楚，众多血管活性物质可能参与了其发生发展[9]。

IMD是Roh等[10]2004年在硬骨鱼体内发现一种血管活性肽，为降钙素基因相关肽超家族的一员，可非选择性地与三型降钙素受体样受体/受体活性调节蛋白受体复合物结合，从而发挥其舒张血管，减轻缺血再灌注损伤的作用。研究显示，IMD可呈剂量依赖性地舒张肺血管，降低肺动脉压力[1]。在慢性低氧所致的肺动脉高压大鼠模型中，肺组织IMD及其受体表达增多[11]，新近研究表明IMD可抑制低氧所致的大鼠肺血管平滑肌细胞增殖和肺血管重构的发生[12]。以上研究结果提示，IMD参与了低氧性肺动脉高压的病理生理过程。我们课题组新近应用皮下埋置微量渗透泵的方法，对腹主动脉-下腔静脉分流大鼠外源性应用IMD，发现IMD亦可缓解大鼠高肺血流性肺血管结构重构的发生[2]。但IMD缓解大鼠高肺血流性肺血管结构重构的机制尚不清楚。

胶原是肺血管细胞外基质的重要组成部分。肺血管壁的胶原成分主要是Ⅰ型和Ⅲ型胶原，其中Ⅰ型胶原与抗张力有关，Ⅲ型胶原与血管壁的弹性有关。胶原代谢异常使Ⅰ、Ⅲ型胶原绝对和相对含量改变，可导致肺动脉管壁增厚，管腔变小，血管顺应性下降，最终导致肺血管结构重构和肺动脉高压的形成[3]。有研究发现，在胆固醇诱导的心肌纤维化的大鼠模型中，外源性应用IMD可减少心肌成纤维细胞胶原合成，抑制心肌纤维化的形成[13]，提示IMD具有调节胶原合成的作用。但IMD对高肺血流大鼠肺组织胶原合成和沉积的作用，以及IMD对于肺组织胶原合成和沉积的作用是否参与了其对高肺血流性肺动脉高压和肺血管结构重构形成的调节机制尚不清楚。在本研究中，我们发现分流大鼠肺组织羟脯氨酸和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量升高，IMD则使分流大鼠肺组织胶原沉积减轻。提示IMD可通过抑制肺组织胶原沉积，缓解肺血管基质重塑，从而减轻高肺血流性肺血管结构重构和肺动脉高压。

IMD缓解肺组织胶原沉积的机制尚不清楚。胶原合成和降解失衡导致胶原绝对和相对含量的改变是肺组织胶原沉积增多的重要原因。IMD是否可通过抑制胶原合成缓解高肺血流大鼠肺组织胶原沉积目前尚不清楚。我们的研究结果发现，IMD在缓解高肺血流大鼠肺组织胶原沉积的同时，可降低Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达。提示IMD可能通过抑制肺组织胶原合成，从而抑制胶原沉积，缓解高肺血流性肺血管结构重构和肺动脉高压的形成。

BMP-2是转化生长因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)超家族的一员，可通过Smads信号通路发挥调节细胞增殖、凋亡和细胞外基质合成的作用。多项研究表明，BMP-2通路的改变参与了肺动脉高压和肺血管结构重构的发生。既往研究表明，外源性应用BMP-2可抑制肺动脉平滑肌细胞增殖和内皮素-1(endothelin-1, ET-1)诱导的肺成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白表达及成纤维细胞迁移[14-15]。BMP-2基因杂合缺失的小鼠肺血管阻力增高，且在炎症、低氧和血清素刺激下更易发生肺动脉高压[16]。本实验研究结果发现，IMD在缓解高肺血流大鼠肺组织胶原生成和沉积以及肺血管结构重构的同时，可使高肺血流大鼠肺组织BMP-2蛋白含量明显下降，提示IMD 抑制高肺血流大鼠肺组织胶原生成与肺血管结构重构的作用可能与BMP-2通路有关。由于机体是多种体液因素参与的复杂的整体，IMD对于BMP-2通路的具体影响和调节途径尚需进一步研究。

总之，我们的研究结果显示，IMD通过抑制肺组织胶原合成和堆积，从而缓解高肺血流性肺动脉高压和肺血管结构重构的形成，此作用可能与BMP-2通路有关。这为高肺血流性肺动脉高压的临床治疗提供了新的思路。

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Intermedin inhibits pulmonary collagen synthesis in rats with pulmonary hypertension induced by high pulmonary blood flow

PANG Lu-lu, QI Jian-guang, GAO Yang, JIN Hong-fang, DU Jun-bao

(DepartmentofPediatrics,FirstHospitalofPekingUniversity,Beijing100034,China.E-mail:qijianguang@sohu.com)

AIM: To explore the regulatory effect of intermedin (IMD) on pulmonary collagen synthesis and accumulation in rats with pulmonary hypertension induced by high pulmonary blood flow.METHODS: Healthy male SD rats (n=20) were randomly divided into control group (n=7), shunt group (n=7) and shunt with IMD group (n=6). The shunting of abdominal aorta and inferior vena cava was produced in rats of shunt group and shunt with IMD group. After 8 weeks, IMD was administered into the rats of shunt with IMD group subcutaneously by mini-osmotic pump for 2 weeks. Mean pulmonary artery pressure (mPAP), relative medial thickness (RMT) of pulmonary arteries, contents of hydroxyproline, collagen type I and III, bone morphogenetic protein-2 (BMP-2), and the mRNA expression of procollagen I and III in lung tissues were measured and compared. RESULTS: Compared with control group, mPAP and RMT of medium and small pulmonary arteries in the rats of shunt group were significantly increased. Meanwhile, the lung hydroxyproline, collagens I and III and BMP-2 contents, and the mRNA expression of lung procollagen I and III were all significantly increased compared with control group. However, IMD significantly decreased mPAP, alleviated the changes of pulmonary vascular micro-structure, decreased the collagen accumulation and pulmonary tissue homogenate BMP-2 contents, and inhibited the mRNA expression of procollagen I and III in the lung tissue of shunting rats.CONCLUSION: IMD plays a protective role in the development of pulmonary hypertension and pulmonary vascular structural remodeling induced by high blood flow by inhibiting pulmonary collagen synthesis and accumulation, possibly in association with the BMP-2 pathway.

Pulmonary hypertension; High pulmonary blood flow; Collagen; Intermedin

1000- 4718(2014)12- 2185- 05

2014- 07- 02

2014- 08- 22

国家自然科学基金资助项目(No.30973226)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.012

△通讯作者 Tel: 010-83573238; E-mail: qijianguang@sohu.com