超高效液相色谱法测定三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的方法研究

姜涛 陈林明 林岱滨

超高效液相色谱法测定三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的方法研究

姜涛 陈林明 林岱滨

目的建立超高效液相色谱法测定三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量的方法。方法采用Agilent 1290型高效液相色谱仪, ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1×50 mm, 1.8 μm)色谱柱, 以乙腈-水为流动相, 梯度洗脱, 流速为0.22 ml/min, 检测波长为203 nm, 进样量为0.4 μl, 柱温为40℃。结果三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1在25 min内实现完全分离, 峰面积在选定的浓度范围内线性良好, 方法回收率、精密度良好。结论超高效液相色谱法可以作为三七药材质量控制的一种快速、方便、可靠的检测手段。

超高效液相色谱法；三七；同时测定

超高效液相色谱法(ultra high performance liquid chromatography , UHPLC)是一种应用小颗粒填料和超高压输液泵的一种新的检测技术。与传统高效液相色谱法(HPLC)相比,超高效液相色谱法具有更快的分析速度［1］。近几年分析者发现超高效液相色谱法也很适用中药这一复杂体系的分析［2］。

三七来源为五加科人参属三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen的干燥根［3］, 具有散瘀止血, 消肿定痛的功效, 主要治疗咯血, 吐血, 衄血, 便血, 崩漏, 外伤出血, 胸腹刺痛,跌扑肿痛［4］, 有“止血神药”之称。2010版《中华人民共和国药典》(以下简称《药典》)中以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1作为三七含量测定的指标［3］。但洗脱过程需要60 min, 加上后平衡时间, 一个样品的分析时长大概得75 min, 耗时较长。本研究在《药典》HPLC条件基础上,利用UHPLC建立了三七含量的快速测定方法。结果表明：与传统HPLC方法相比, 该法具有可明显缩短分析周期、灵敏度高和节省溶剂的的优点, 有良好的应用前景。

1 仪器与材料

超高效液相色谱仪, Agilent 1290 Infinity型(包括二元泵、自动进样器、柱温箱及二极管阵列检测器), 人参皂苷Rg1对照品(中国食品药品检定研究院, 批号: 110703-201128)、

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：ZORBAX Ecilpse plus C18, RRHD 2.1×50 mm, 1.8 μm；流动相：乙腈(A)-水(B), 梯度洗脱［2.4→8 min, 19:81→20:80; 8→12 min, 20:80→36:64; 12→15 min, 36:64→36:64; 15→16 min, 36:64→79:21; 16→20 min, 79:21→79:21］；流速：0.220 mL/min；检测波长：203 nm；柱温：40℃；进样量：0.4 μ l。对照品及供试品色谱图见图1, 图2。

图1 三七混合对照品色谱图

图2 三七供试品色谱图

2.2对照品溶液的制备 精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1对照品适量, 加甲醇制成每1毫升含三七皂苷R10.1 mg、人参皂苷Rg10.3 mg、人参皂苷Rb10.4 mg的混合溶液, 摇匀, 0.22 μm滤过, 取续滤液, 即得。

2.3供试品溶液的制备 精密称取三七粉末(过四号筛)0.6 g, 精密称定, 精密加入甲醇50 ml, 称定重量, 放置过夜, 置80℃水浴上保持微沸2 h, 放冷, 再称定重量, 用甲醇补足减失的重量, 摇匀, 0.22 μm滤过, 取续滤液, 即得。

2.4线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μl, 注入超高效液相色谱仪, 以色谱峰峰面积(Y)为纵坐标, 对照品进样量(X)为横坐标绘制标准曲线, 得到人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1三种成分的回归方程。三七皂苷R1的回归方程为Y=7292.6X-20.380(r=0.9999),线性范围为0.0216～0.0648 μg；人参皂苷Rg1的回归方程为Y=7806.7X-50.820 (r=0.9998), 线性范围为0.0606～0.1819 μg；人参皂苷Rb1的回归方程为Y=6970.8X-43.810(r=0.9999), 线性范围为0.0819～0.2458 μg。表明该方法线性关系良好。

2.5准确度试验 精密称取已知含量的三七药材粉末6份,每份约0.4 g, 精密称定, 置于250 ml具塞锥形瓶中, 精密加入混合对照品溶液20 ml, 按“2.3”项目下的方法制备供试品溶液, 依“2.1”法测定, 计算三个组分回收率, 平均回收率如下：三七皂苷R1为 101.19%, RSD为2.9%, 人参皂苷Rg1为118.02%, RSD为0.9%, 人参皂苷Rb1为99.73%, RSD为0.9%。表明该方法准确度良好。

2.6精密度试验 精密称取三七药材粉末0.6 g, 按“2.3”项目下进行处理得供试品溶液, 平行操作6份, 按照“2.1”项目下的色谱条件进行测定, 记录三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的峰面积, 并计算其相对标准偏差RSD,其结果分别为1.08%、0.71%、0.49%, 表明该方法重复性良好。

2.7稳定性试验 取“2.6”项下供试品溶液, 按照“2.1”项目下的色谱条件分别于0、2、4、8、12、20 h进行测定,记录三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的峰面积,并计算其相对标准偏差RSD, 其结果分别为0.98%、1.57%、0.38%, 表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3 讨论

3.1在本次试验中, 三七中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的色谱峰与相邻峰的分离度分别为3.6、8.7和3.4, 均符合2010版《中华人民共和国药典》的附录要求。与HPLC方法相比, UHPLC方法明显地降低检测时间, 在13 min内即可将三七中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1三种待测成分完全分离。

3.2相对HPLC常用5 μm粒径的填料, UHPLC使用的1.8 μm的填料粒径更小, 根据范德米特(Van Deemeter)方程, 小粒径填料可得到更佳的柱效, 可缩短分析时间。另外, 选用2.1 mm内径的色谱柱, 可有效减少溶剂扩散效应, 达到高分离效率的需求。但由于整柱体积比以往色谱柱小, 分析复杂样品时更容易出现堵塞现象, 故在15 min后用高强度有机相冲洗以防止柱堵塞现象。

综上所述, 采用超高效液相色谱法测定三七中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量, 大大降低了三七含量测定时间, 提高了工作效率, 可以作为三七药材质量控制的一种快速、方便、可靠的检测手段。

［1］ 杨乔森.超高效液相色谱的特点分析及在药物领域的应用.中国石油和化工标准与质量, 2012, 33(10):230.

［2］ 金高娃, 章飞芳, 薛兴亚, 等.超高效液相色谱在复杂体系中药分离分析中的应用.世界科学技术-中医药现代化, 2006, 8(3):106-111.

［3］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京: 化学工业出版社, 2010:11-12.

［4］ 肖培根.新编中药志.第1卷.北京: 化学工业出版社, 2001: 17-22.

Method study of ultra high performance liquid chromatography in determination of notoginsenoside R1and ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1in panax notoginseng

JIANG Tao, CHEN Lin-ming, LIN Dai-bin.

Kangmei Pharmaceutical Co, Jieyang 515300, China

ObjectiveTo establish the determination method for notoginsenoside R1and ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1in panax notoginseng by ultra high performance liquid chromatography.MethodsThis study was performed on Agilent 1290 high performance liquid chromatography and ZORBAX Ecilpse Plus C18(2.1×50 mm, 1.8 μm) chromatographic column with acetonitrile-water as mobile phase in gradient elution at the flow rate of 0.220 ml/min.The detection wavelength was 203 nm, the injection volume was 0.4 μl, and the column temperature was 40℃.ResultsNotoginsenoside R1, ginsenosides Rg1and ginsenosides Rb1in panax notoginseng could be completely separated in 25 min.The peak area had good linear relationship in the certain range.The recovery rate and precision of the method were good.ConclusionAs an new quality control method of panax notoginseng, ultra high performance liquid chromatography is fast, convenient and reliable.

Ultra high performance liquid chromatography; Panax notoginseng; Simultaneous determination

515300 康美药业股份有限公司人参皂苷Rb1对照品(中国食品药品检定研究院, 批号: 110704-201122)、三七皂苷R1对照品(中国药品生物制品检定所, 批号: 110745-200415)；乙腈(Merck, 批号: I68253031)为色谱纯；水为Sartorius 超纯水；其他试剂为分析纯；三七药材, 经康美药业股份有限公司刘茂贵技术顾问鉴定为五加科人参属三七。

2014-08-11］