沙棘叶片总RNA提取方法的比较研究

李小婷等

摘要：沙棘叶片富含多糖、多酚、蛋白质、类黄酮等次生代谢物质，用普通方法提取沙棘叶片总RNA时很难将其去除。本试验以沙棘叶片为材料，比较研究了改良Trizol法、 RNAsimple 总RNA提取试剂盒（离心柱型）、RNAplant Plus总RNA提取试剂以及RNAplant Plus 总RNA提取试剂改良法等4种方法对沙棘叶片总RNA的提取效果。结果表明，RNAplant Plus总RNA提取试剂改良法能从沙棘叶片中提取纯度较高的RNA，凝胶电泳显示条带清晰完整，鲜叶平均得率为298.1 μg/g，D260 nm/D280 nm 比值为1.79，用该方法提取的沙棘叶片总RNA可以用于后续的分子生物学研究中。

关键词：沙棘叶片；总RNA提取；提取方法

中图分类号： S793.604 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0033-02

提取获得纯度高、质量好的RNA是进行cDNA第一链合成、RT-PCR、RACE-PCR、cDNA全长克隆和Northern杂交等分子生物学研究的必要前提[1-2]。沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.），又名醋柳、酸刺，是胡颓子科沙棘属（Hippophae）的灌木或小乔木。沙棘广泛分布于黄土高原、毛乌素沙地及其毗邻地区，在水土保持、防风固沙及治理砒砂岩等方面发挥着重要的生态作用[3]。沙棘叶片中含有大量的多糖、多酚、粗蛋白、类黄酮等次生代谢物质[4]，加之RNAase的广泛存在，使获得纯度较高的沙棘叶片总RNA变得十分困难。传统提取RNA的方法有异硫氰酸胍法、苯酚法、SDS法、CTAB法、Tris-硼酸法及Trizol法等，这些方法可以有效地提取大部分动物组织RNA，但高等植物组织内含有一些多糖类和酚类物质，使用这些方法很难去除[5]。本试验采用4种RNA提取试剂 （盒） 进行系统比较分析，以期筛选出提取高质量沙棘叶片总RNA的方法，为开展沙棘后续分子生物研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的沙棘叶片采自陕西省定边县西南林业大学实习基地，为移栽后2年的实生苗嫩叶，采后迅速放入液氮中带回实验室-80 ℃保存。

试验所用主要试剂有Trizol （Invitrogen公司产品）、RNA simple 总RNA提取试剂盒 （离心柱型） （天根公司产品）、RNAplant Plus 总RNA提取试剂 （天根公司产品），DEPC （Sigma公司），其他试剂均为RNA试验专用。

1.2 方法

1.2.1 改良Trizol法 按照Invitrogen 公司试剂说明书进行，并加以改进：取0.1 g沙棘叶片液氮研磨成细粉后加 0.1 g PVP （聚乙烯吡咯烷酮） 继续研磨，待液氮挥发后将混合粉末迅速加入已装好Trizol的1.5 mL无RNAase离心管中，摇匀前迅速加入10 μL β-巯基乙醇；加入氯仿之前加 200 μL 5 mol/L NaCl 混匀；氯仿抽提，取上清后加入等体积酚-氯仿-异戊醇（体积比25 ∶ 24 ∶ 1），重新抽提1次。

1.2.2 RNAsimple总RNA提取试剂盒（离心柱型） 参照天根公司试剂盒说明书进行。

1.2.3 RNAplant Plus总RNA提取试剂法 参照天根公司试剂说明书进行。使用前按照1 ∶ 4的体积比将β-巯基乙醇与RNAplant Plus reagent混合。

1.2.4 RNAplant Plus总RNA提取试剂改良法 在加氯仿之前按1 ∶ 250的体积比加入DNA酶Ⅰ，轻轻吹打混匀 1 min，然后参照天根公司试剂说明书进行。

1.2.5 总RNA的完整性检测 分别取5μL总RNA样品，在1%琼脂糖凝胶电泳中检测，EB（溴化乙锭）中染色后，凝胶成像系统成像观察，记录结果。

1.2.6 总RNA的纯度检测 将用4种方法提取的总RNA分别取2 μL，用无RNAase的DEPC水稀释50倍，在核酸蛋白仪上测定D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm值，分析其纯度。

得率（μg/g）=D260 nm×40（μg/mL）×稀释倍数×RNA原液体积（mL）/所取样品质量（g）。

2 结果与分析

2.1 沙棘叶片总RNA完整性分析

4种不同方法提取的RNA经1%琼脂糖凝胶电泳 （图1），结果表明，改良TRIzol法和RNAsimple 总RNA提取试剂盒 （离心柱型） 的凝胶电泳未检测出RNA；RNAplant Plus 总RNA提取试剂法得到的沙棘总RNA电泳图谱可以看到亮度很高的28S和18S 2条带，且28 条带与18S条带亮度比约为2 ∶ 1，但在28S上方可见明显的其他条带，表明有基因组DNA杂质；而RNAplant Plus 总RNA提取试剂改良法在加入DNA酶Ⅰ之后成功地去除了DNA，并且对总RNA质量、浓度影响不大。

2.2 沙棘叶片总RNA纯度分析

用改良Trizol法、 RNAsimple 总RNA提取试剂盒 （离心

柱型）、RNAplant Plus总RNA提取试剂法以及RNAplant Plus 总RNA提取试剂改良法4种方法提取沙棘叶片总RNA，在核酸蛋白仪上进行分析，结果如表1所示。

一般认为较纯净的RNA样品，其D260 nm/D280 nm应为 1.7～2.0，D260 nm/D230 nm应大于2.0。由表1可见，改良Trizol法和 RNAsimple 总RNA提取试剂盒 （离心柱型）提取的RNA的D260 nm/D280 nm分别为1.47和1.28，均小于1.7，表明这2种方法提取的RNA样品纯度较差，不能有效去除总RNA样品中蛋白质或酚类等有机物杂质。同时，这2种方法提取的总RNA样品的D260 nm/D230 nm分别为0.33和0.79，表明这2种方法也不能有效地去除其中的萜类化合物等次生代谢物。RNAplant Plus总RNA提取试剂法提取法的RNA样品D260 nm/D280 nm大于1.7，表明这种方法可以去除蛋白质和酚类物质的干扰；但D260 nm/D230 nm小于2.0，可能是受到基因组DNA的干扰。而RNplant Plus 总RNA提取试剂改良法提取的RNA D260 nm/D280 nm为1.79，D260 nm/D230 nm为2.07，表明这种方法提取的RNA纯度高，不存在多糖、蛋白质及酚类物质等杂质。

改良Trizol法和 RNAsimple 总RNA提取试剂盒（离心柱型）2种方法获得的总RNA得率都很低，分别为55.1、33.7 μg/g （RNA/样品）；而RNAplant Plus总RNA提取试剂法和RNAplant Plus 总RNA提取试剂改良法的总RNA得率都较高，但RNAplant Plus总RNA提取试剂改良法的RNA产率为298.1 μg/g，低于RNAplant Plus总RNA提取试剂法的433.4 μg/g（表1），可能是由于前者加入的DNA酶Ⅰ对RNA也起到了一定的降解作用，造成了RNA产量有所下降，也可能是后者对DNA的去除不彻底，对RNA的得率有所影响。

从试验所需时间上来看，改良Trizol法所需时间最长，需 6.0 h；而其他3种方法所需时间相差不大，均为3 h左右（表1）。

试验数据综合表明，RNAplant Plus总RNA提取试剂改良法是提取沙棘叶片RNA的最佳方法。

3 结论与讨论

RNA的纯度和完整性是分子生物学试验成功的关键性因素[1-2]。在植物细胞中，多糖和酚类物质与核酸在空间上是相互分离的，但对组织进行研磨破碎后，它们会与RNA相互作用，从而影响RNA的提取及后续反应[6]。多糖的理化性质与核酸极为相似，往往在去除多糖的同时造成RNA产量的下降[7-8]；而酚类物质残留在样品中会发生氧化产生深褐色的物质[9]，所以使用传统方法提取的RNA往往带有很深的铁锈色。而且RNase活性很强，整个试验过程中，微量的外源RNase或内源RNase都会使RNA发生降解，因此，在RNA提取过程中必须抑制RNase活性并克服这些次生代谢产物的干扰，从而得到质量较好、纯度较高的RNA[10-11]。

Trizol内含异硫氰酸胍等变性剂，改良Ttizol法在提取过程中加入PVP、β-巯基乙醇以及NaCl以去除多糖、多酚等杂质，孙德权等[12]、苏丹等[13]用改良Trizol法获得了富含多糖、多酚类次生代谢物质的香蕉叶片和辣椒组织的总RNA。RNAsimple总RNA提取试剂盒 （离心柱型） 使用了硅基质膜，以增强对RNA的吸附能力，朱永平等[14]利用该种方法成功获得了墨兰舌瓣的总RNA。但可能是由于不同植物及同一植物的不同组织所含次生代谢物质的种类和含量有所差异，而这些次生代谢物质往往是影响RNA提取效果的关键因素之一[15]，用这2种方法提取的沙棘叶片总RNA并不理想，因此这2种方法并不适用于沙棘叶片RNA的提取。

RNAplant Plus总RNA提取试剂改良法在加入DNA酶Ⅰ后，虽对RNA得率有所影响，但有效地去除了RNA中的基因组DNA的干扰，同时对RNA的质量影响不大。而且这种方法提取RNA所需时间较短，操作简单，是目前提取沙棘叶片总RNA的理想方法。

改良Trizol法和 RNAsimple 总RNA提取试剂盒（离心柱型）2种方法获得的总RNA得率都很低，分别为55.1、33.7 μg/g （RNA/样品）；而RNAplant Plus总RNA提取试剂法和RNAplant Plus 总RNA提取试剂改良法的总RNA得率都较高，但RNAplant Plus总RNA提取试剂改良法的RNA产率为298.1 μg/g，低于RNAplant Plus总RNA提取试剂法的433.4 μg/g（表1），可能是由于前者加入的DNA酶Ⅰ对RNA也起到了一定的降解作用，造成了RNA产量有所下降，也可能是后者对DNA的去除不彻底，对RNA的得率有所影响。

从试验所需时间上来看，改良Trizol法所需时间最长，需 6.0 h；而其他3种方法所需时间相差不大，均为3 h左右（表1）。

试验数据综合表明，RNAplant Plus总RNA提取试剂改良法是提取沙棘叶片RNA的最佳方法。

3 结论与讨论

RNA的纯度和完整性是分子生物学试验成功的关键性因素[1-2]。在植物细胞中，多糖和酚类物质与核酸在空间上是相互分离的，但对组织进行研磨破碎后，它们会与RNA相互作用，从而影响RNA的提取及后续反应[6]。多糖的理化性质与核酸极为相似，往往在去除多糖的同时造成RNA产量的下降[7-8]；而酚类物质残留在样品中会发生氧化产生深褐色的物质[9]，所以使用传统方法提取的RNA往往带有很深的铁锈色。而且RNase活性很强，整个试验过程中，微量的外源RNase或内源RNase都会使RNA发生降解，因此，在RNA提取过程中必须抑制RNase活性并克服这些次生代谢产物的干扰，从而得到质量较好、纯度较高的RNA[10-11]。

Trizol内含异硫氰酸胍等变性剂，改良Ttizol法在提取过程中加入PVP、β-巯基乙醇以及NaCl以去除多糖、多酚等杂质，孙德权等[12]、苏丹等[13]用改良Trizol法获得了富含多糖、多酚类次生代谢物质的香蕉叶片和辣椒组织的总RNA。RNAsimple总RNA提取试剂盒 （离心柱型） 使用了硅基质膜，以增强对RNA的吸附能力，朱永平等[14]利用该种方法成功获得了墨兰舌瓣的总RNA。但可能是由于不同植物及同一植物的不同组织所含次生代谢物质的种类和含量有所差异，而这些次生代谢物质往往是影响RNA提取效果的关键因素之一[15]，用这2种方法提取的沙棘叶片总RNA并不理想，因此这2种方法并不适用于沙棘叶片RNA的提取。

RNAplant Plus总RNA提取试剂改良法在加入DNA酶Ⅰ后，虽对RNA得率有所影响，但有效地去除了RNA中的基因组DNA的干扰，同时对RNA的质量影响不大。而且这种方法提取RNA所需时间较短，操作简单，是目前提取沙棘叶片总RNA的理想方法。

改良Trizol法和 RNAsimple 总RNA提取试剂盒（离心柱型）2种方法获得的总RNA得率都很低，分别为55.1、33.7 μg/g （RNA/样品）；而RNAplant Plus总RNA提取试剂法和RNAplant Plus 总RNA提取试剂改良法的总RNA得率都较高，但RNAplant Plus总RNA提取试剂改良法的RNA产率为298.1 μg/g，低于RNAplant Plus总RNA提取试剂法的433.4 μg/g（表1），可能是由于前者加入的DNA酶Ⅰ对RNA也起到了一定的降解作用，造成了RNA产量有所下降，也可能是后者对DNA的去除不彻底，对RNA的得率有所影响。

从试验所需时间上来看，改良Trizol法所需时间最长，需 6.0 h；而其他3种方法所需时间相差不大，均为3 h左右（表1）。

试验数据综合表明，RNAplant Plus总RNA提取试剂改良法是提取沙棘叶片RNA的最佳方法。

3 结论与讨论

RNA的纯度和完整性是分子生物学试验成功的关键性因素[1-2]。在植物细胞中，多糖和酚类物质与核酸在空间上是相互分离的，但对组织进行研磨破碎后，它们会与RNA相互作用，从而影响RNA的提取及后续反应[6]。多糖的理化性质与核酸极为相似，往往在去除多糖的同时造成RNA产量的下降[7-8]；而酚类物质残留在样品中会发生氧化产生深褐色的物质[9]，所以使用传统方法提取的RNA往往带有很深的铁锈色。而且RNase活性很强，整个试验过程中，微量的外源RNase或内源RNase都会使RNA发生降解，因此，在RNA提取过程中必须抑制RNase活性并克服这些次生代谢产物的干扰，从而得到质量较好、纯度较高的RNA[10-11]。

Trizol内含异硫氰酸胍等变性剂，改良Ttizol法在提取过程中加入PVP、β-巯基乙醇以及NaCl以去除多糖、多酚等杂质，孙德权等[12]、苏丹等[13]用改良Trizol法获得了富含多糖、多酚类次生代谢物质的香蕉叶片和辣椒组织的总RNA。RNAsimple总RNA提取试剂盒 （离心柱型） 使用了硅基质膜，以增强对RNA的吸附能力，朱永平等[14]利用该种方法成功获得了墨兰舌瓣的总RNA。但可能是由于不同植物及同一植物的不同组织所含次生代谢物质的种类和含量有所差异，而这些次生代谢物质往往是影响RNA提取效果的关键因素之一[15]，用这2种方法提取的沙棘叶片总RNA并不理想，因此这2种方法并不适用于沙棘叶片RNA的提取。

RNAplant Plus总RNA提取试剂改良法在加入DNA酶Ⅰ后，虽对RNA得率有所影响，但有效地去除了RNA中的基因组DNA的干扰，同时对RNA的质量影响不大。而且这种方法提取RNA所需时间较短，操作简单，是目前提取沙棘叶片总RNA的理想方法。