响应面法优化紫云英根瘤菌发酵条件

吕黎等

摘要：在摇瓶培养条件下，采用响应面法对紫云英根瘤菌的发酵条件进行优化。以单因素试验确定的蔗糖浓度、酵母膏浓度、初始pH值为自变量，以根瘤菌活菌数为响应值，利用Box-Behnken试验设计原理及Design Expert 8.0软件进行回归分析，得到紫云英根瘤菌最佳发酵条件，即蔗糖浓度2.19%，酵母膏浓度0.9%，初始pH值 6.89，该条件下，根瘤菌活菌数为20.533亿CFU/mL。通过3次平行试验验证表明，在优化后的发酵条件下根瘤菌活菌数实测值为20.497亿CFU/mL，与预测值相对误差为0.2%，表明模型拟合效果良好。

关键词：响应面法；紫云英根瘤菌；发酵条件

中图分类号： S182 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0323-03

收稿日期：2013-08-27

基金项目：湖南省长沙市科技计划（编号：K1308090-21）。

作者简介：吕黎（1985—），女，河南信阳人，硕士，实习工程师，从事微生物工程和菌株遗传改良研究。Tel：（0731）83285950；E-mail：ll-137@163.com。

通信作者：丰来，硕士，助理工程师，从事微生物工程与酶制剂研究。E-mail：fenglai@taigubio.com。紫云英别称翘摇、红花草等，是一种能形成共生固氮体系的豆科植物[1]。在我国水稻种植区，紫云英作为稻田绿肥，具有改善土壤理化性状、平衡土壤生态环境、促进土壤有机碳积累、提高作物产量和品质等重要作用[2-3]。此外，紫云英还具有较高的食用、饲用价值。美国、日本、韩国等发达国家正在大力发展紫云英产业[4]。近年来随着耕地质量下降，肥料利用率降低，土壤、水源污染严重，农产品品质下降，紫云英种植在我国逐渐引起重视[5]。与大豆、花生等豆科植物一样，种植紫云英时须要根瘤菌形成共生固氮体系，以促进生产和保证产量。经研究发现，接种根瘤菌可显著提高紫云英结瘤率，提高紫云英总苗数、株高、单株分枝数、单株鲜重等生长指标，使其产量增加11%～17%，效果显著[6-7]。在初次种植紫云英的土壤中接种有效根瘤菌是决定其产量的重要因素，在多年连作地区接种优良菌株也能促进增产[8]。目前，市场上紫云英根瘤菌菌剂产品类型和有效活菌数少，不能有效满足当前紫云英产业的发展。本研究采用响应曲面法对紫云英根瘤菌发酵条件进行优化，以确定最佳发酵组合，以期为紫云英根瘤菌菌剂的高密度、大规模发酵生产提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株紫云英根瘤菌（Rhizobium astragali）菌株ACCC 13004。

1.1.2培养基YMA液体培养基：10 g/L甘露醇、3 g/L酵母膏、0.5 g/L K2HPO4、0.2 g/L MgSO4·7H2O、0.1 g/L NaCl、 0.2 g/L CaSO4、4 mL/L Rh 微量元素液（5 g/L H3BO3，5 g/L NaMnO4），余量为水，pH值 6.8～7.0。YMA斜面培养基：YMA液体培养基加入1.8%琼脂。

1.1.3主要仪器和设备1102C型恒温振荡培养箱（上海知楚仪器有限公司），SW-CJ-1G型超净工作台（苏州净化有限公司），LRH-150型生化培养箱（上海一恒科学仪器公司），LDZX-50KB型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器厂），Labnet P3960移液枪（美国莱伯特公司），YP-B10002型电子天平（上海光正医疗仪器有限公司），PHS-25型pH计（上海盛磁仪器有限公司）。

1.2方法

1.2.1种子液培养斜面菌种28 ℃活化24 h后，取2环接入装有200 mL YMA液体培养基的500 mL三角瓶中，28 ℃振荡培养48 h后，按照5%接种量接入单因素试验及 Box-Behnken 试验培养基中。

1.2.2活菌数测定方法采用平板菌落计数法测定活菌数。

1.2.3单因素分析法

1.2.3.1碳源浓度对活菌数的影响陈海荣等研究发现，紫云英根瘤菌在甘露醇、蔗糖中生长较好[8]，但因甘露醇生产成本较高，所以选定蔗糖作为碳源。试验条件为0.9%酵母膏、0.05% K2HPO4、0.02% MgSO4·7H2O、0.01% NaCl、002% CaSO4、4 mL/L Rh 微量元素液，初始pH值 7.0，蔗糖浓度分别为1%、1.5%、2%、2.5%、3%，28 ℃摇瓶培养48 h，测定活菌数以确定最佳蔗糖浓度。

1.2.3.2氮源浓度对活菌数的影响确定最佳蔗糖浓度后，将酵母膏浓度分别设为0.1%、0.5%、0.9%、1.3%、1.7%，培养基其他组分不变，初始pH值 7.0，28 ℃摇瓶培养48 h，测定活菌数以确定最佳酵母膏浓度。

1.2.3.3初始pH值对活菌数的影响将碳源、氮源设定为上述试验确定的最佳浓度，培养基其他组分不变，将初始pH值分别设为 6.5、7、7.5、8、8.5，28 ℃摇瓶培养48 h，测定活菌数以确定最佳初始pH值。

1.2.4响应面法优化紫云英根瘤菌发酵条件根据 Box-Behnken 试验设计原理，将单因素试验确定的最佳蔗糖浓度、酵母膏浓度、初始pH值作为自变量，以活菌数为响应值，设计3因素3水平的响应面分析试验，进一步对紫云英根瘤菌发酵条件进行优化。

2结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1最佳蔗糖浓度的确定由图1可知，当蔗糖浓度较低时，紫云英根瘤菌活菌数随着蔗糖浓度的增大而增加；当蔗糖浓度为2%时，活菌数达到最大值；之后，紫云英根瘤菌活菌数略有下降。因此确定最佳蔗糖浓度为2%。

2.1.2最佳酵母膏浓度的确定由图2可知，在一定范围内，紫云英活菌数随着酵母膏浓度增大而增加，当酵母膏浓度为0.9%、1.3%时活菌数较高，但两者差异较小，考虑到生产成本问题，所以确定最佳酵母膏浓度为0.9%。

2.1.3最佳初始pH值的确定微生物在生长过程中机体内的绝大多数反应是酶促反应，而酶促反应需要一个最适初始pH值范围，在该范围内只要条件适合，酶促反应速率最高，微生物生长速率最大[9]。由图3可知，随着初始pH值增加，紫云英根瘤菌活菌数呈先升高后降低的趋势，当pH值为70时，活菌数最大，所以确定最佳初始pH值为7.0。

2.2响应面法优化紫云英根瘤菌发酵条件

2.2.1Box-Behnken 试验设计根据单因素试验结果，确定中心点为蔗糖浓度2%、酵母膏浓度0.9%、pH值7.0。表1是响应面法优化紫云英根瘤菌发酵条件试验的因素及水平，表2是试验设计和结果。采用Design-Expert 8软件对试验结果进行二次回归方程预测及方差分析，结果见表3。

3结论与讨论

许多学者开展了关于根瘤菌培养基优化的研究[10]，但主要集中在大豆、花生等经济作物上，而有关紫云英根瘤菌发酵的研究鲜有报道。紫云英根瘤菌的常用培养基是YMA培养基，由于YMA培养基是半合成培养基，在被用于大规模发酵生产时成本较高[11]。本研究从降低发酵成本角度，以蔗糖、

酵母膏为主要原料优化紫云英根瘤菌发酵培养基。微生物生长受多种外界因素的影响，如营养条件、pH值等，其中碳源、氮源是微生物生长需要最多的营养成分。在微生物发酵生产时，提供适量碳源、氮源，既能达到生长量，又不造成资源浪费。pH值是影响微生物生长的主要因素之一，发酵生产时，对初始pH值的控制尤为重要。本研究通过单因素试验确定碳源（蔗糖）浓度、氮源（酵母膏）浓度、初始pH值后，进一步采用响应曲面设计法进行优化。

响应曲面设计法是一种寻找多因子系统中最佳条件的数学统计方法，通过对函数响应面和等高线的分析，能够精确研究各因子之间的关系，从而获得最优工艺参数[12]。本研究借助Design Expert 8软件进行响应面试验的设计和数据分析，在紫云英根瘤菌发酵培养基优化过程中取得良好的效果，并获得二次回归模型，得到最佳培养基为：蔗糖浓度2.19%，酵母膏浓度0.9%，初始pH值 6.89，该条件下根瘤菌活菌数为20.533亿CFU/mL。通过3次平行试验验证表明，该模型合理可靠，能够较好地预测紫云英根瘤菌实际发酵情况，为紫云英根瘤菌工业化发酵生产提供了技术支持。

参考文献：

[1]陈坚，张辉，朱炳耀，等. 紫云英SSR分子标记的开发及在品种鉴别中的应用[J]. 作物学报，2011，37（9）：1592-1596.

[2]沈生元，莫美英，赵洪祥，等. 氮磷肥单施和配施对紫云英产量及耕地质量的影响[J]. 江苏农业科学，2010（5）：131-132.

[3]王华，黄宇，阳柏苏，等. 中亚热带红壤地区稻-稻-草轮作系统稻田土壤质量评价[J]. 生态学报，2005，25（12）：3271-3281.

[4]林新坚，曹卫东，吴一群，等. 紫云英研究进展[J]. 草业科学，2011，28（1）：135-140.

[5]陈海荣，郭照辉，魏小武，等. 根瘤菌肥对紫云英生长的影响研究[J]. 现代农业科技，2012（10）：260-261，264.

[6]李青盛. 紫云英接种根瘤菌剂的效果[J]. 农技服务，2010，27（7）：856.

[7]刘英，郭熙盛，王允青，等. 紫云英根瘤菌应用效果研究[J]. 安徽农业科学，2012，40（24）：12046-12047.

[8]陈海荣，郭照辉，刘前刚，等. 紫云英根瘤菌培养基的选择与优化[J]. 湖南农业科学，2011（1）：13-15.

[9]曾晓希，周洪波，柳建设，等. 脱硅细菌B.mucilaginosus Lv1-2的培养条件研究[J]. 现代生物医学进展，2006，6（9）：5-7.

[10]迟玉成，Fan T Q，樊堂群，等. 慢生型花生根瘤菌培养基优化研究[J]. 花生学报，2007，36（4）：25-28.

[11]刘保平，周俊初. 根瘤菌菌剂研究[J]. 湖北农业科学，2006，45（1）：57-61.

[12]Vadde K K，Syrotiuk V R，Montgomery D C. Optimizing protocol interaction using response surface methodology[J]. IEEE Transations on Mobile Computing，2006，5（6）：627-639.

2.1.3最佳初始pH值的确定微生物在生长过程中机体内的绝大多数反应是酶促反应，而酶促反应需要一个最适初始pH值范围，在该范围内只要条件适合，酶促反应速率最高，微生物生长速率最大[9]。由图3可知，随着初始pH值增加，紫云英根瘤菌活菌数呈先升高后降低的趋势，当pH值为70时，活菌数最大，所以确定最佳初始pH值为7.0。

2.2响应面法优化紫云英根瘤菌发酵条件

2.2.1Box-Behnken 试验设计根据单因素试验结果，确定中心点为蔗糖浓度2%、酵母膏浓度0.9%、pH值7.0。表1是响应面法优化紫云英根瘤菌发酵条件试验的因素及水平，表2是试验设计和结果。采用Design-Expert 8软件对试验结果进行二次回归方程预测及方差分析，结果见表3。

3结论与讨论

许多学者开展了关于根瘤菌培养基优化的研究[10]，但主要集中在大豆、花生等经济作物上，而有关紫云英根瘤菌发酵的研究鲜有报道。紫云英根瘤菌的常用培养基是YMA培养基，由于YMA培养基是半合成培养基，在被用于大规模发酵生产时成本较高[11]。本研究从降低发酵成本角度，以蔗糖、

酵母膏为主要原料优化紫云英根瘤菌发酵培养基。微生物生长受多种外界因素的影响，如营养条件、pH值等，其中碳源、氮源是微生物生长需要最多的营养成分。在微生物发酵生产时，提供适量碳源、氮源，既能达到生长量，又不造成资源浪费。pH值是影响微生物生长的主要因素之一，发酵生产时，对初始pH值的控制尤为重要。本研究通过单因素试验确定碳源（蔗糖）浓度、氮源（酵母膏）浓度、初始pH值后，进一步采用响应曲面设计法进行优化。

响应曲面设计法是一种寻找多因子系统中最佳条件的数学统计方法，通过对函数响应面和等高线的分析，能够精确研究各因子之间的关系，从而获得最优工艺参数[12]。本研究借助Design Expert 8软件进行响应面试验的设计和数据分析，在紫云英根瘤菌发酵培养基优化过程中取得良好的效果，并获得二次回归模型，得到最佳培养基为：蔗糖浓度2.19%，酵母膏浓度0.9%，初始pH值 6.89，该条件下根瘤菌活菌数为20.533亿CFU/mL。通过3次平行试验验证表明，该模型合理可靠，能够较好地预测紫云英根瘤菌实际发酵情况，为紫云英根瘤菌工业化发酵生产提供了技术支持。

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[2]沈生元，莫美英，赵洪祥，等. 氮磷肥单施和配施对紫云英产量及耕地质量的影响[J]. 江苏农业科学，2010（5）：131-132.

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[4]林新坚，曹卫东，吴一群，等. 紫云英研究进展[J]. 草业科学，2011，28（1）：135-140.

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[6]李青盛. 紫云英接种根瘤菌剂的效果[J]. 农技服务，2010，27（7）：856.

[7]刘英，郭熙盛，王允青，等. 紫云英根瘤菌应用效果研究[J]. 安徽农业科学，2012，40（24）：12046-12047.

[8]陈海荣，郭照辉，刘前刚，等. 紫云英根瘤菌培养基的选择与优化[J]. 湖南农业科学，2011（1）：13-15.

[9]曾晓希，周洪波，柳建设，等. 脱硅细菌B.mucilaginosus Lv1-2的培养条件研究[J]. 现代生物医学进展，2006，6（9）：5-7.

[10]迟玉成，Fan T Q，樊堂群，等. 慢生型花生根瘤菌培养基优化研究[J]. 花生学报，2007，36（4）：25-28.

[11]刘保平，周俊初. 根瘤菌菌剂研究[J]. 湖北农业科学，2006，45（1）：57-61.

[12]Vadde K K，Syrotiuk V R，Montgomery D C. Optimizing protocol interaction using response surface methodology[J]. IEEE Transations on Mobile Computing，2006，5（6）：627-639.

2.1.3最佳初始pH值的确定微生物在生长过程中机体内的绝大多数反应是酶促反应，而酶促反应需要一个最适初始pH值范围，在该范围内只要条件适合，酶促反应速率最高，微生物生长速率最大[9]。由图3可知，随着初始pH值增加，紫云英根瘤菌活菌数呈先升高后降低的趋势，当pH值为70时，活菌数最大，所以确定最佳初始pH值为7.0。

2.2响应面法优化紫云英根瘤菌发酵条件

2.2.1Box-Behnken 试验设计根据单因素试验结果，确定中心点为蔗糖浓度2%、酵母膏浓度0.9%、pH值7.0。表1是响应面法优化紫云英根瘤菌发酵条件试验的因素及水平，表2是试验设计和结果。采用Design-Expert 8软件对试验结果进行二次回归方程预测及方差分析，结果见表3。

3结论与讨论

许多学者开展了关于根瘤菌培养基优化的研究[10]，但主要集中在大豆、花生等经济作物上，而有关紫云英根瘤菌发酵的研究鲜有报道。紫云英根瘤菌的常用培养基是YMA培养基，由于YMA培养基是半合成培养基，在被用于大规模发酵生产时成本较高[11]。本研究从降低发酵成本角度，以蔗糖、

酵母膏为主要原料优化紫云英根瘤菌发酵培养基。微生物生长受多种外界因素的影响，如营养条件、pH值等，其中碳源、氮源是微生物生长需要最多的营养成分。在微生物发酵生产时，提供适量碳源、氮源，既能达到生长量，又不造成资源浪费。pH值是影响微生物生长的主要因素之一，发酵生产时，对初始pH值的控制尤为重要。本研究通过单因素试验确定碳源（蔗糖）浓度、氮源（酵母膏）浓度、初始pH值后，进一步采用响应曲面设计法进行优化。

响应曲面设计法是一种寻找多因子系统中最佳条件的数学统计方法，通过对函数响应面和等高线的分析，能够精确研究各因子之间的关系，从而获得最优工艺参数[12]。本研究借助Design Expert 8软件进行响应面试验的设计和数据分析，在紫云英根瘤菌发酵培养基优化过程中取得良好的效果，并获得二次回归模型，得到最佳培养基为：蔗糖浓度2.19%，酵母膏浓度0.9%，初始pH值 6.89，该条件下根瘤菌活菌数为20.533亿CFU/mL。通过3次平行试验验证表明，该模型合理可靠，能够较好地预测紫云英根瘤菌实际发酵情况，为紫云英根瘤菌工业化发酵生产提供了技术支持。

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[3]王华，黄宇，阳柏苏，等. 中亚热带红壤地区稻-稻-草轮作系统稻田土壤质量评价[J]. 生态学报，2005，25（12）：3271-3281.

[4]林新坚，曹卫东，吴一群，等. 紫云英研究进展[J]. 草业科学，2011，28（1）：135-140.

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[6]李青盛. 紫云英接种根瘤菌剂的效果[J]. 农技服务，2010，27（7）：856.

[7]刘英，郭熙盛，王允青，等. 紫云英根瘤菌应用效果研究[J]. 安徽农业科学，2012，40（24）：12046-12047.

[8]陈海荣，郭照辉，刘前刚，等. 紫云英根瘤菌培养基的选择与优化[J]. 湖南农业科学，2011（1）：13-15.

[9]曾晓希，周洪波，柳建设，等. 脱硅细菌B.mucilaginosus Lv1-2的培养条件研究[J]. 现代生物医学进展，2006，6（9）：5-7.

[10]迟玉成，Fan T Q，樊堂群，等. 慢生型花生根瘤菌培养基优化研究[J]. 花生学报，2007，36（4）：25-28.

[11]刘保平，周俊初. 根瘤菌菌剂研究[J]. 湖北农业科学，2006，45（1）：57-61.

[12]Vadde K K，Syrotiuk V R，Montgomery D C. Optimizing protocol interaction using response surface methodology[J]. IEEE Transations on Mobile Computing，2006，5（6）：627-639.