超声波破碎法提取多食鞘氨醇杆菌中17β—雌二醇降解酶的优化及酶学性质

王飞　张丽

摘要：采用超声波破碎多食鞘氨醇杆菌细胞壁的方法提取雌二醇降解酶，通过单因素条件研究确定各因素对超声波破碎影响的高低，依据Box-Benhnken设计原则对破碎条件进行响应面回归模型分析（RSA）。研究得到最佳条件为：菌体浓度188 mg/mL，破碎功率400 W，总破碎时间29 min（超声3 s，间隔5 s），认为破碎功率对超声波破碎的影响最大。预测破碎后得到的粗酶液总酶活力为1.484 U，实际测得的粗酶液酶活力为1.477 U。根据试验结果认为：采用超声波破碎方法可以较好地提取氨肽酶，运用响应面分析法优化超声波破碎条件是可行的。

关键词：ED4菌株；超声波破碎；E2降解酶

中图分类号：Q814.1；X172 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）04-0310-04

收稿日期：2013-08-23

基金项目：江苏省自然科学基金（编号：SBK201022464）。

作者简介：王飞（1988—），女，安徽合肥人，硕士研究生，研究方向为微生物学。E-mail：wang576180559@126.com。

通信作者：张丽，女，硕士，副教授，研究方向为生物化工。E-mail：njust_zhangli@163.com。近年来，甾体雌激素因其对生物体内分泌系统产生的种种不利影响而引起人们的广泛关注[1-3]。甾体雌激素是一种环境内分泌干扰物质（endocrine-disrupting compounds，EDCs），是指能够进入生物体内的外源性物质，可干扰生物体内天然激素的产生、释放、代谢、交互作用，从而对生物体正常的体内激素平衡、代谢生长和行为产生干扰作用[4]。17β-雌二醇（E2）被认为是最具潜在影响、作用最强烈且在水环境中普遍存在的一种甾体雌激素，当其质量浓度低至ng/L级时仍可对水生生物繁殖、生态安全乃至人类健康造成极大的潜在威胁[5-6]。目前雌激素污染的生物修复主要通过从被污染的土壤与水质中分离筛选降解菌，再将其用于雌激素的生物降解、修复[7-12]。本研究采用超声波破碎E2降解菌细胞壁的方法提取E2降解酶，通过单因素条件研究、响应面分析优化超声波破碎的最佳条件，旨在为E2降解酶的研究和E2降解途径的建立奠定初步的研究基础。

1材料与方法

1.1试验材料

试验菌株：多食鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium multivolum）ED4，能高效降解17β-雌二醇，由笔者所在实验室分离获得。

试验药品：17β-雌二醇（17β-estradiol，E2），纯度>98%，购自美国Sigma。

试验仪器：超净工作台，上海新苗医疗器械制造有限公司；超声波细胞破碎仪，汕头市科毅仪器设备有限公司；HC-3518高速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司；DSX-280A手提式灭菌锅，上海申骋仪器科技有限公司；752N分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。

1.2试验方法

1.2.1菌体制备从4 ℃冰箱中保存的LB斜面上挑取ED4菌株，连续活化3代，按2%接种量，在30 ℃条件下扩大培养至对数生长期时取出，离心收集菌体沉淀（4 ℃、5 000 r/min条件下离心20 min）；用pH值为7的磷酸缓冲溶液清洗、离心，反复洗涤后用无机盐培养基将菌液稀释到D600 nm为约0.5后，便制成菌悬液。

1.2.2粗酶液的制备将ED4菌种进行产酶培养72 h后，冰浴条件下用超声波破碎细胞，300 W破碎4 s，间隔8 s，共破碎30 min；于10 000 r/min、4 ℃条件下高速离心30 min，收集上清液即为粗酶液。

1.2.317β-雌二醇降解酶活力的测定方法先向20 mL试管中加入9 mL 0.05 mol/L磷酸盐缓冲溶液（含10 mg/L 17β-雌二醇），再加入1mL粗酶液，30 ℃水浴中反应1 h后加入05 mL 1 mol/L的HCl溶液终止酶反应。每个处理重复2次。在一定温度和pH值条件下，1 min内减少1 μg 17β-雌二醇所需的酶量为1个酶活力单位，用U表示[13]。

1.2.4超声波破碎条件的确定首先根据单因素试验确定菌体浓度、破碎功率、破碎时间3个条件对超声波破碎的影响，然后按Box-Behnken原理设计试验，以菌体浓度、破碎功率、破碎时间为响应变量，根据单因素试验确定上下水平后，用Design-Expert 8.0.7.1软件进行响应面优化分析。破碎中用冰水浴冷却样品。

2结果与分析

2.1单因素超声波破碎条件

2.1.1菌体浓度对超声波破碎提取17β-雌二醇降解酶的影响在超声波破碎功率为300 W、超声破碎总时间为 26 min （工作时间4 s，间隔时间6 s）的条件下，配置50～350 mg/mL 不同浓度的ED4降解菌菌体悬液进行细胞破碎。由图1可以看出，当菌体浓度为200 mg/mL时，17β-雌二醇降解酶的酶活力最高，但是随着破碎体系中菌体浓度逐渐升高，酶活力随之降低，这可能是当菌体浓度过高时，超声波破碎难以形成空穴效应，产生的多余热量降低了破碎效率并破坏了降解酶活性。

2.1.2破碎功率对超声波破碎提取17β-雌二醇降解酶的影响当菌体悬液浓度为200 mg/mL时，在100～600 W的范围内调节超声破碎功率，破碎26 min（工作4 s，间隔6 s）。图2结果表明，当破碎功率为300 W时，17β-雌二醇降解酶的酶活力最高；随着破碎功率的不断增加，降解酶活力逐渐下降；破碎功率过低时，降解酶释放不完全而使酶活力较低；破碎功率超过最佳值时，由于超声波空化现象而导致热能增加，从而破坏了酶活性。

2.1.3破碎时间对超声波破碎提取17β-雌二醇的影响设菌体悬液浓度为200 mg/mL，超声破碎功率为300 W，破碎时间分别为5、12、19、26、33、40、47 min（工作4 s，间隔6 s）。图3结果表明，在菌体浓度和超声波破碎功率保持不变的前提下，17β-雌二醇降解酶的酶活力在破碎时间为26 min时达到最大值；随着破碎时间的增加，降解酶活力呈下降趋势。可能随着时间的增加，超声产生的热量也逐渐增多，从而导致酶活力下降。endprint

2.2超声波提取17β-雌二醇降解酶条件的优化

以破碎功率、菌体浓度、破碎时间为响应变量，根据单因素试验确定上下水平后，按Box-Behnken原理设计试验并进行优化分析。各试验组的因素水平设计见表1，试验分组及结果见表2。

3结论

本试验研究了1株17β-雌二醇高效降解菌的超声破碎的优化条件。首先利用单因素试验确定了破碎时间、破碎功率、菌体浓度等最佳破碎条件，然后用中心组合设计和响应面分析法确定了影响因子的取值。优化后的破碎条件为破碎功率400 W、破碎时间29 min、菌体浓度188 mg/mL。在此破碎条件下，降解酶酶活力为1.477 U，与预测值拟合良好，说明该模型能很好地预测实际破碎情况。

参考文献：

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2.2超声波提取17β-雌二醇降解酶条件的优化

以破碎功率、菌体浓度、破碎时间为响应变量，根据单因素试验确定上下水平后，按Box-Behnken原理设计试验并进行优化分析。各试验组的因素水平设计见表1，试验分组及结果见表2。

3结论

本试验研究了1株17β-雌二醇高效降解菌的超声破碎的优化条件。首先利用单因素试验确定了破碎时间、破碎功率、菌体浓度等最佳破碎条件，然后用中心组合设计和响应面分析法确定了影响因子的取值。优化后的破碎条件为破碎功率400 W、破碎时间29 min、菌体浓度188 mg/mL。在此破碎条件下，降解酶酶活力为1.477 U，与预测值拟合良好，说明该模型能很好地预测实际破碎情况。

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2.2超声波提取17β-雌二醇降解酶条件的优化

以破碎功率、菌体浓度、破碎时间为响应变量，根据单因素试验确定上下水平后，按Box-Behnken原理设计试验并进行优化分析。各试验组的因素水平设计见表1，试验分组及结果见表2。

3结论

本试验研究了1株17β-雌二醇高效降解菌的超声破碎的优化条件。首先利用单因素试验确定了破碎时间、破碎功率、菌体浓度等最佳破碎条件，然后用中心组合设计和响应面分析法确定了影响因子的取值。优化后的破碎条件为破碎功率400 W、破碎时间29 min、菌体浓度188 mg/mL。在此破碎条件下，降解酶酶活力为1.477 U，与预测值拟合良好，说明该模型能很好地预测实际破碎情况。

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