湖南石门磺厂矿区尾矿库抗砷菌株的分离、鉴定及性质研究

管思琪等

摘要：在湖南石门磺厂采集含砷尾砂样品和水样，利用选择性培养基富集培养和分离，获得13株对砷有抗性的菌株，这些菌株属于Pseudomonas otitidis和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），均能在较高浓度的砷培养液中生存，主要通过还原砷达到对砷的高抗性作用。其中，菌株SM-T1对As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的抗性分别达到了60 mmol/L和100 mmol/L，该菌株最适生长pH值为7.0～8.0，最适生长温度为20 ℃；在砷浓度未达到致死浓度时，砷浓度对 SM-T1 的生长速度影响较大，对其最终的生长状况影响较小。这为进一步利用砷抗性菌开展含砷环境的生物修复奠定了良好的基础。

关键词：湖南石门；砷矿区；砷抗性菌；氧化还原；最适生长条件

中图分类号： X172 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0300-03

收稿日期：2013-08-29

基金项目：国家自然科学基金（编号：40930742）；国家重点基础研究发展计划（编号：2014CB846004）。

作者简介：管思琪（1987—），女，江苏南通人，硕士，从事环境微生物研究。

通信作者：王睿勇。Tel：（025）83592685；E-mail：wangry@nju.edu.cn。随着社会经济发展，自然环境正面临着空前压力，砷污染日益加重便是其中之一。砷（As）是一种类金属，广泛存在于岩石圈、水圈和生物圈[1]，可能导致膀胱癌、肾癌、肝癌、肺癌、皮肤癌等的发生，被美国环境保护署列为典型致癌物[2]。砷可导致急性中毒和慢性中毒，在砷污染严重地区比如孟加拉国和印度引起极大关注。在我国很多地区也存在不同程度的砷污染，目前超过10个省、自治区发现了饮用水型砷中毒，因此，含砷化合物污染和防治已引起人们的普遍关注[3]。

砷污染对人类主要影响来自地方性的砷中毒和饮用水中砷含量超标。2001年，世界卫生组织建议将饮用水中砷的最高限度由原来的50 μg/L调整为10 μg/L[4]，如何治理砷污染，特别是如何从源头上防止砷污染引起了人们的广泛关注。目前主要的砷污染治理方法是将高毒性的砷转化为低毒性的砷，或者将水体中的砷转化为低水溶性或不溶于水的物质。近年来，研究者发现砷抗性菌可以通过对砷的氧化/还原、吸附/去吸附、甲基化/去甲基化、沉淀/溶解等途径来降低环境中砷的毒性[5-7]。砷抗性菌对砷的各种作用为治理砷污染提供了新的思路。

矿业活动是导致砷污染的重要原因之一。从1850年工业革命到21世纪初，全球人为活动向环境排放的砷含量逐年增加，其中矿业活动产生的砷量占72.6%[8]。全球砷矿分布不均，其中，砷探明储量的70%集中在中国。湖南石门有国内外最大的雄磺矿，距今已有1 500年的开采历史，年产砷矿3 000 t左右，在矿物开采过程中，极大污染了周围的大气、水和土壤环境，曾经引起居民砷中毒事件的发生。本试验以该矿区的尾砂、水样为研究对象，筛选分离砷抗性菌，对其进行鉴定，并研究抗性菌对砷的氧化还原能力，为砷抗性菌的生物修复利用奠定基础。

1材料与方法

1.1含砷尾砂、水样采集及其地化分析

尾砂来源于湖南省石门县白云乡界牌村的磺厂矿部选矿厂（29°38.727′N，111°2.049′E）；水样来自矿厂一号窿二平硐口（29°38.760′N，111°2.130′E），现场测定pH值。采回的新鲜样品充分混匀后，取一部分立刻进行细菌分离，剩余的样品经冷冻干燥，参照孙青等的方法[9]测定元素含量。

1.2试验方法

1.2.1抗砷菌的富集、分离与纯化抗砷富集培养基：1 L 去离子水中加入（NH）2SO4 2.0 g、乙酸钠2.0 g、酵母提取物0.5 g 、胰蛋白胨1.0 g、葡萄糖0.2 g，pH值为7.5±0.2。培养基灭菌后，无菌加入NaAsO2至终浓度为10 mmol/L。制备固体培养基时，1 L培养基加入10.0 g琼脂。取尾砂1.0 g或水样20 mL加入100 mL抗砷富集培养基中，30 ℃、120 r/min摇床培养3 d；取1 mL富集培养液转接到新的抗砷富集培养基中，转接2次；将第3次转接的富集培养物梯度稀释后，涂布于抗砷富集培养基平板上，30 ℃培养3 d后划线分离至纯培养，获得单菌落，转接斜面保存备用。

1.2.2抗砷菌的鉴定 参照东秀珠等的方法[10]进行。

1.2.3抗砷菌的抗性试验采用含有As的R2A培养基进行抗性鉴定。将R2A培养基中As（Ⅲ）浓度调节为10、20、30、40、50、60 mmol/L，将As（Ⅴ）浓度调节为20、40、60、80、100、120 mmol/L；然后分别接入菌液，接种细胞密度约为 1×106个/mL，30 ℃、120 r/min条件下培养120 h；600 nm下测定吸光度D值，确定As（Ⅲ）的最小致死浓度和最大抗砷浓度。以大肠杆菌为对照菌株。

1.2.4菌株氧化、还原砷能力确定采用高锰酸钾法。原理：高锰酸钾具有强氧化性，与As（Ⅲ）接触时氧化As（Ⅲ），同时自身还原而褪去红色。检验方法为：取50 μL R2A培养液、4 μL 0.01 mol/L高锰酸钾溶液和946 μL无菌水摇匀。空白1为不加砷、高压灭菌的R2A培养基50 μL，空白2为不接种、高温高压灭菌的R2A培养基50 μL，检测样为含有 10 mmol/L As（Ⅲ）或As（Ⅴ）的R2A培养基50 μL。

将菌种接入As（Ⅲ）浓度为10 mmol/L的R2A培养基，30 ℃、120 r/min下培养168 h。72 h和168 h各检测1次，空白样1中红色不褪去，空白样2中红色褪去，样品红色不褪去或变淡，即该菌种具有砷氧化功能（图1）。endprint

将菌种接入As（Ⅴ）浓度为10 mmol/L的R2A培养基，30 ℃、120 r/min下培养168 h，72 h和168 h各检测1次，空白样1中红色不褪去，空白样2中红色不褪去，样品红色褪去，即该菌种具有砷还原功能（图2）。

1.2.5菌株SM-T1的最适生长条件试验

1.2.5.1pH值对SM-T1生长的影响分别将As（Ⅲ）浓度为10 mmol/L的R2A培养基初始pH值调为5.0、6.0、70、8.0、9.0，接种SM-T1种子液，孢子浓度控制在 1×106个/mL，30 ℃、120 r/min条件下培养48 h，测定D值，确定细菌在不同pH值下的生长情况。

1.2.5.2温度对SM-T1生长的影响将温度分别设置为15、20、25、30、35 ℃，接种SM-T1种子液，孢子浓度 1×106个/mL，120 r/min下培养48 h，测定D值，确定细菌在不同温度下的生长情况。

1.2.5.3不同砷浓度对SM-T1生长的影响在获得最适pH值和最适温度条件下，将As（Ⅲ）浓度设置为0、10、20、30 mmol/L，接种SM-T1种子液，孢子浓度1×106个/mL，120 r/min 条件下培养72 h，每隔4 h用分光光度计测定D值1次，确定细菌在不同浓度As（Ⅲ）条件下的生长曲线。

2结果与分析

2.1尾砂和水样的化学分析结果

本研究共采集10个尾砂样品和3个水样，典型样品的元素分析结果（表1）表明，尾矿SM-T-1和SM-T-6的砷含量极高，超过了质量的30%，除Ca、Mg、Al外，2个样品的其他金属含量也均高于其他尾矿样品；水样SM-S-4的砷含量也达到了24.0%，除Ca、Mg外，主要金属含量也均高于其他样品。参照国标GB 15618—1995《土壤环境质量标准》，所有样品砷含量均达到重度污染程度。水样分析表明，pH值为中性，砷含量严重超标，达到30 mg/L以上。

2.2抗砷菌的富集培养、分离、纯化和鉴定

经过含AS（Ⅲ）浓度为10 mmol/L的抗砷培养基富集培养、相同浓度抗性平板筛选及多次划线分离，所有样品都分离得到了抗砷菌株，说明砷抗性菌在该环境中普遍存在。对分离获得的13株细菌（均为好氧杆菌）进行形态学和生理学鉴定，结合16S rDNA序列分析，初步鉴定这13株细菌为Pseudomonas otitidis和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。典型菌株的16S rDNA序列分析结果如图3所示。

2.3菌株的抗砷试验

由表2可见，13个菌株都有很强的抗砷能力：除菌株 SM-S-7 外，其他菌株对As（Ⅲ）的抗性都超过40 mmol/L，对AS（Ⅴ）的抗性超过60 mmol/L。对砷抗性最强的是菌株SM-T1，其对As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的抗性分别达到60 mmol/L和 100 mmol/L；As（Ⅲ）的毒性虽然比As（Ⅴ）的毒性要大得多，但是13个菌株对两者的抵抗能力差异不大，这可能是菌株对砷发生氧化还原作用所致。

2.4抗砷菌对砷的氧化、还原作用

用高锰酸钾法鉴定结果表明，大部分菌株对As（Ⅴ）有还原性，As（Ⅴ）被还原为As（Ⅲ）后，As（Ⅲ）对细胞的毒性更强，这可能也是这些菌株对As（Ⅲ）和As（Ⅴ）耐受能力差别不大的原因。

2.5菌株SM-T1最适生长条件

3小结与讨论

通过在湖南石门璜矿采集含砷尾砂样品和水样，在实验室利用选择性培养基富集培养和分离，获得13株对砷有抗性的菌株；对菌株的鉴定表明，它们属于Pseudomonas otitidis和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。对砷的抗性试验表

明，13个菌株均能在较高浓度的砷培养液中生存，主要通过还原砷达到对砷的高抗性作用，其中，菌株SM-T1对As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的抗性分别达到了60 mmol/L和100 mmol/L。

对典型抗性菌株SM-T1研究表明，菌株SM-T1能在pH值5.0～9.0、温度15～35 ℃范围内生长，最适生长pH值为7.0～8.0、最适生长温度为20 ℃。在砷浓度未达到致死浓度时，砷浓度对SM-T1生长影响较大，对其最终的生长状况影响较小，细菌可以进行正常旺盛的细胞分裂。这为进一步利用砷抗性菌开展含砷环境的生物修复奠定了良好基础。

参考文献：

[1]Cullen W R，Reimer K J. Arsenic speciation in the environment[J]. Chemical Review，1989，89（4）：713-764.

[2]Chen M，Ma L Q，Harris W G. Arsenic concentrations in florida surface soils：influence of soil type and properties[J]. Soil Sci Soc J，2002，66：632-640.

[3]王薇，徐炎华. 水体中砷污染和治理概况[J]. 微量元素与健康研究，2005，22（5）：59-61.

[4]Gomez-Caminero A，Howe P，Hughes M，et al. Environmental health criteria 224 arsenic and arsenic compounds[R]. Geneva：World Health Organization，2001.

[5]Turpeinen R，Pantsar-Kallio M，Hggblom M，et al. Influence of microbes on the mobilization，toxicity and biomethylation of arsenic in soil[J]. Science of the Total Environment，1999，236（1/3）：173-180.

[6]Silver S，Phung L T. Genes and enzymes involved in bacterial oxidation and reduction of inorganic arsenic[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（2）：599-608.

[7]Kashyap D R，Botero L M，Franck W L，et al. Complex regulation of arsenite oxidation in Agrobacterium tumefaciens[J]. Journal of Bacteriology，2006，188（3）：1081-1088.

[8]Han F X，Su Y，Monts D L，et al. Assessment of global industrial-age anthropogenic arsenic contamination[J]. Naturwissenschaften，2003，90（9）：395-401.

[9]孙青，邢辉，何斌，等. 安徽铜陵狮子山硫化物矿山酸矿水中微生物功能群的研究[J]. 岩石矿物学杂志，2009，28（6）：547-552.

[10]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001：370-398.endprint

将菌种接入As（Ⅴ）浓度为10 mmol/L的R2A培养基，30 ℃、120 r/min下培养168 h，72 h和168 h各检测1次，空白样1中红色不褪去，空白样2中红色不褪去，样品红色褪去，即该菌种具有砷还原功能（图2）。

1.2.5菌株SM-T1的最适生长条件试验

1.2.5.1pH值对SM-T1生长的影响分别将As（Ⅲ）浓度为10 mmol/L的R2A培养基初始pH值调为5.0、6.0、70、8.0、9.0，接种SM-T1种子液，孢子浓度控制在 1×106个/mL，30 ℃、120 r/min条件下培养48 h，测定D值，确定细菌在不同pH值下的生长情况。

1.2.5.2温度对SM-T1生长的影响将温度分别设置为15、20、25、30、35 ℃，接种SM-T1种子液，孢子浓度 1×106个/mL，120 r/min下培养48 h，测定D值，确定细菌在不同温度下的生长情况。

1.2.5.3不同砷浓度对SM-T1生长的影响在获得最适pH值和最适温度条件下，将As（Ⅲ）浓度设置为0、10、20、30 mmol/L，接种SM-T1种子液，孢子浓度1×106个/mL，120 r/min 条件下培养72 h，每隔4 h用分光光度计测定D值1次，确定细菌在不同浓度As（Ⅲ）条件下的生长曲线。

2结果与分析

2.1尾砂和水样的化学分析结果

本研究共采集10个尾砂样品和3个水样，典型样品的元素分析结果（表1）表明，尾矿SM-T-1和SM-T-6的砷含量极高，超过了质量的30%，除Ca、Mg、Al外，2个样品的其他金属含量也均高于其他尾矿样品；水样SM-S-4的砷含量也达到了24.0%，除Ca、Mg外，主要金属含量也均高于其他样品。参照国标GB 15618—1995《土壤环境质量标准》，所有样品砷含量均达到重度污染程度。水样分析表明，pH值为中性，砷含量严重超标，达到30 mg/L以上。

2.2抗砷菌的富集培养、分离、纯化和鉴定

经过含AS（Ⅲ）浓度为10 mmol/L的抗砷培养基富集培养、相同浓度抗性平板筛选及多次划线分离，所有样品都分离得到了抗砷菌株，说明砷抗性菌在该环境中普遍存在。对分离获得的13株细菌（均为好氧杆菌）进行形态学和生理学鉴定，结合16S rDNA序列分析，初步鉴定这13株细菌为Pseudomonas otitidis和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。典型菌株的16S rDNA序列分析结果如图3所示。

2.3菌株的抗砷试验

由表2可见，13个菌株都有很强的抗砷能力：除菌株 SM-S-7 外，其他菌株对As（Ⅲ）的抗性都超过40 mmol/L，对AS（Ⅴ）的抗性超过60 mmol/L。对砷抗性最强的是菌株SM-T1，其对As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的抗性分别达到60 mmol/L和 100 mmol/L；As（Ⅲ）的毒性虽然比As（Ⅴ）的毒性要大得多，但是13个菌株对两者的抵抗能力差异不大，这可能是菌株对砷发生氧化还原作用所致。

2.4抗砷菌对砷的氧化、还原作用

用高锰酸钾法鉴定结果表明，大部分菌株对As（Ⅴ）有还原性，As（Ⅴ）被还原为As（Ⅲ）后，As（Ⅲ）对细胞的毒性更强，这可能也是这些菌株对As（Ⅲ）和As（Ⅴ）耐受能力差别不大的原因。

2.5菌株SM-T1最适生长条件

3小结与讨论

通过在湖南石门璜矿采集含砷尾砂样品和水样，在实验室利用选择性培养基富集培养和分离，获得13株对砷有抗性的菌株；对菌株的鉴定表明，它们属于Pseudomonas otitidis和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。对砷的抗性试验表

明，13个菌株均能在较高浓度的砷培养液中生存，主要通过还原砷达到对砷的高抗性作用，其中，菌株SM-T1对As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的抗性分别达到了60 mmol/L和100 mmol/L。

对典型抗性菌株SM-T1研究表明，菌株SM-T1能在pH值5.0～9.0、温度15～35 ℃范围内生长，最适生长pH值为7.0～8.0、最适生长温度为20 ℃。在砷浓度未达到致死浓度时，砷浓度对SM-T1生长影响较大，对其最终的生长状况影响较小，细菌可以进行正常旺盛的细胞分裂。这为进一步利用砷抗性菌开展含砷环境的生物修复奠定了良好基础。

参考文献：

[1]Cullen W R，Reimer K J. Arsenic speciation in the environment[J]. Chemical Review，1989，89（4）：713-764.

[2]Chen M，Ma L Q，Harris W G. Arsenic concentrations in florida surface soils：influence of soil type and properties[J]. Soil Sci Soc J，2002，66：632-640.

[3]王薇，徐炎华. 水体中砷污染和治理概况[J]. 微量元素与健康研究，2005，22（5）：59-61.

[4]Gomez-Caminero A，Howe P，Hughes M，et al. Environmental health criteria 224 arsenic and arsenic compounds[R]. Geneva：World Health Organization，2001.

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[6]Silver S，Phung L T. Genes and enzymes involved in bacterial oxidation and reduction of inorganic arsenic[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（2）：599-608.

[7]Kashyap D R，Botero L M，Franck W L，et al. Complex regulation of arsenite oxidation in Agrobacterium tumefaciens[J]. Journal of Bacteriology，2006，188（3）：1081-1088.

[8]Han F X，Su Y，Monts D L，et al. Assessment of global industrial-age anthropogenic arsenic contamination[J]. Naturwissenschaften，2003，90（9）：395-401.

[9]孙青，邢辉，何斌，等. 安徽铜陵狮子山硫化物矿山酸矿水中微生物功能群的研究[J]. 岩石矿物学杂志，2009，28（6）：547-552.

[10]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001：370-398.endprint

将菌种接入As（Ⅴ）浓度为10 mmol/L的R2A培养基，30 ℃、120 r/min下培养168 h，72 h和168 h各检测1次，空白样1中红色不褪去，空白样2中红色不褪去，样品红色褪去，即该菌种具有砷还原功能（图2）。

1.2.5菌株SM-T1的最适生长条件试验

1.2.5.1pH值对SM-T1生长的影响分别将As（Ⅲ）浓度为10 mmol/L的R2A培养基初始pH值调为5.0、6.0、70、8.0、9.0，接种SM-T1种子液，孢子浓度控制在 1×106个/mL，30 ℃、120 r/min条件下培养48 h，测定D值，确定细菌在不同pH值下的生长情况。

1.2.5.2温度对SM-T1生长的影响将温度分别设置为15、20、25、30、35 ℃，接种SM-T1种子液，孢子浓度 1×106个/mL，120 r/min下培养48 h，测定D值，确定细菌在不同温度下的生长情况。

1.2.5.3不同砷浓度对SM-T1生长的影响在获得最适pH值和最适温度条件下，将As（Ⅲ）浓度设置为0、10、20、30 mmol/L，接种SM-T1种子液，孢子浓度1×106个/mL，120 r/min 条件下培养72 h，每隔4 h用分光光度计测定D值1次，确定细菌在不同浓度As（Ⅲ）条件下的生长曲线。

2结果与分析

2.1尾砂和水样的化学分析结果

本研究共采集10个尾砂样品和3个水样，典型样品的元素分析结果（表1）表明，尾矿SM-T-1和SM-T-6的砷含量极高，超过了质量的30%，除Ca、Mg、Al外，2个样品的其他金属含量也均高于其他尾矿样品；水样SM-S-4的砷含量也达到了24.0%，除Ca、Mg外，主要金属含量也均高于其他样品。参照国标GB 15618—1995《土壤环境质量标准》，所有样品砷含量均达到重度污染程度。水样分析表明，pH值为中性，砷含量严重超标，达到30 mg/L以上。

2.2抗砷菌的富集培养、分离、纯化和鉴定

经过含AS（Ⅲ）浓度为10 mmol/L的抗砷培养基富集培养、相同浓度抗性平板筛选及多次划线分离，所有样品都分离得到了抗砷菌株，说明砷抗性菌在该环境中普遍存在。对分离获得的13株细菌（均为好氧杆菌）进行形态学和生理学鉴定，结合16S rDNA序列分析，初步鉴定这13株细菌为Pseudomonas otitidis和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。典型菌株的16S rDNA序列分析结果如图3所示。

2.3菌株的抗砷试验

由表2可见，13个菌株都有很强的抗砷能力：除菌株 SM-S-7 外，其他菌株对As（Ⅲ）的抗性都超过40 mmol/L，对AS（Ⅴ）的抗性超过60 mmol/L。对砷抗性最强的是菌株SM-T1，其对As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的抗性分别达到60 mmol/L和 100 mmol/L；As（Ⅲ）的毒性虽然比As（Ⅴ）的毒性要大得多，但是13个菌株对两者的抵抗能力差异不大，这可能是菌株对砷发生氧化还原作用所致。

2.4抗砷菌对砷的氧化、还原作用

用高锰酸钾法鉴定结果表明，大部分菌株对As（Ⅴ）有还原性，As（Ⅴ）被还原为As（Ⅲ）后，As（Ⅲ）对细胞的毒性更强，这可能也是这些菌株对As（Ⅲ）和As（Ⅴ）耐受能力差别不大的原因。

2.5菌株SM-T1最适生长条件

3小结与讨论

通过在湖南石门璜矿采集含砷尾砂样品和水样，在实验室利用选择性培养基富集培养和分离，获得13株对砷有抗性的菌株；对菌株的鉴定表明，它们属于Pseudomonas otitidis和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。对砷的抗性试验表

明，13个菌株均能在较高浓度的砷培养液中生存，主要通过还原砷达到对砷的高抗性作用，其中，菌株SM-T1对As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的抗性分别达到了60 mmol/L和100 mmol/L。

对典型抗性菌株SM-T1研究表明，菌株SM-T1能在pH值5.0～9.0、温度15～35 ℃范围内生长，最适生长pH值为7.0～8.0、最适生长温度为20 ℃。在砷浓度未达到致死浓度时，砷浓度对SM-T1生长影响较大，对其最终的生长状况影响较小，细菌可以进行正常旺盛的细胞分裂。这为进一步利用砷抗性菌开展含砷环境的生物修复奠定了良好基础。

参考文献：

[1]Cullen W R，Reimer K J. Arsenic speciation in the environment[J]. Chemical Review，1989，89（4）：713-764.

[2]Chen M，Ma L Q，Harris W G. Arsenic concentrations in florida surface soils：influence of soil type and properties[J]. Soil Sci Soc J，2002，66：632-640.

[3]王薇，徐炎华. 水体中砷污染和治理概况[J]. 微量元素与健康研究，2005，22（5）：59-61.

[4]Gomez-Caminero A，Howe P，Hughes M，et al. Environmental health criteria 224 arsenic and arsenic compounds[R]. Geneva：World Health Organization，2001.

[5]Turpeinen R，Pantsar-Kallio M，Hggblom M，et al. Influence of microbes on the mobilization，toxicity and biomethylation of arsenic in soil[J]. Science of the Total Environment，1999，236（1/3）：173-180.

[6]Silver S，Phung L T. Genes and enzymes involved in bacterial oxidation and reduction of inorganic arsenic[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（2）：599-608.

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[9]孙青，邢辉，何斌，等. 安徽铜陵狮子山硫化物矿山酸矿水中微生物功能群的研究[J]. 岩石矿物学杂志，2009，28（6）：547-552.

[10]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001：370-398.endprint