超声破碎酵母细胞提取蔗糖酶条件优化

李聪　朱晓吉

摘要：采用单因素试验和L9（33）正交试验确定酿酒酵母的最佳超声破碎条件。结果表明，酿酒酵母的最佳超声破碎条件为：破碎功率350 W、总工作时间25 min、工作时间/间歇时间15 s/25 s。

关键词：酵母细胞；蔗糖酶；酶活性；超声破碎法；正交试验

中图分类号： TS201.2+5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0237-03

收稿日期：2013-08-26

作者简介：李聪（1984—），女，辽宁抚顺人，硕士研究生，助理实验师，研究方向为食品微生物发酵。E-mail：lcfayewong@126.com。蔗糖酶（sucrase，EC 3.2.1.26）别称转化酶，能催化蔗糖水解产生葡萄糖、果糖，是一种广泛存在于自然界中的糖苷酶[1]。目前蔗糖酶已在农产品加工业[2]、食品工业[3-4]、医药行业[5-6]中发挥重要作用。工业上一般从酵母中提取蔗糖酶[7]。蔗糖酶属于胞内水解酶，提取时须对酵母细胞进行破壁处理，酵母细胞的破壁方法主要有机械研磨法、酶解法、反复冻融法等[8]，这些方法都有一些不足之处，例如酶解法耗时长、费用高，机械研磨法操作复杂、损耗大等[9]。超声波具有空化效应，会产生机械剪切压力而使细胞破碎[10-11]。本研究采用超声波法破碎酵母细胞，以期找出有效保存酵母蔗糖酶活性的超声破碎条件。

1材料与方法

1.1菌株

酿酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）GY 7，由辽宁石油化工大学化学化工与环境学部实验室保存。

1.2培养基

种子培养基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏 15 g/L，氯化钠4 g/L，pH值 7.0。

摇瓶发酵培养基：葡萄糖 20 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4 1 g/L，pH 值5.5。

1.3仪器设备

立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；全温振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技生物有限公司）。

1.4方法

1.4.1酿酒酵母的培养及收集向装有30 mL液体种子培养基的250 mL三角瓶中接种两环斜面种子，30 ℃、150 r/min 振荡培养24 h，得到二级种子液。将二级种子液以10%的接种量接入100 mL发酵培养基中，29 ℃、摇床转速160 r/min条件下培养27 h左右。取菌液于4 000 r/min离心10 min，得到酵母菌体细胞。

1.4.2超声破碎酿酒酵母将离心得到的菌体用pH值4.6的醋酸-醋酸钠缓冲液冲洗2次，取菌体1 g，加入到50 mL缓冲液中充分振荡混匀制成菌悬液，在超声细胞破碎仪中破碎，破碎条件按单因素试验和正交试验表进行。

1.4.3酵母蔗糖酶的提取 将超声破碎后细胞悬浊液于 12 000 r/min 离心20 min，得到上清即为粗酶液。向粗酶液中加入乙醇使其质量分数达30%，4 ℃放置过夜，12 000 r/min 离心15 min，取上清液，再追加投入乙醇使其终质量分数达50%。4 ℃放置1 h，12 000 r/min离心15 min，弃上清液，沉淀用双蒸水溶解，4 ℃保存[12]。

3结论与讨论

酿酒酵母细胞壁较厚，在超声破碎过程中超声功率的选择非常重要，功率较小影响酵母细胞破碎率，导致酵母蔗糖酶活力较低；而功率过大则会引起细胞悬液飞溅或产生泡沫。

超声破碎的工作时间/间歇时间对蔗糖酶活力有显著影响，当超声破碎时间大于间歇时间时，超声破碎过程中产生了较多热量，而较短的间歇时间使热量无法散发，从一定程度上破坏了蔗糖酶活性。因此设定工作时间/间歇时间时，应使超声时间短于间歇时间。

本研究以酵母蔗糖酶活力为指标，将超声破碎功率、总工作时间、工作时间/间歇时间列为考察因素，通过单因素试验及正交试验探寻超声破碎酵母细胞的最佳条件。试验优化后的超声破碎条件为超声功率350 W，总工作时间25 min，工作时间/间歇时间15 s/25 s。优化后的超声破碎酵母细胞法与酸碱裂解法、反复冻融法、酶解法相比，更为简便、快捷、经济、实用，适于实验室及小规模的破碎酵母提取蔗糖酶等胞内活性物质试验。

参考文献：

[1]郭小路，张万秋，阙瑞琦，等. 薄荷幼叶蔗糖酶的分离纯化与部分性质[J]. 西南大学学报：自然科学版，2008，30（2）：90-94.

[2]梁东丽，谷洁，高华，等. 不同禽畜粪便静态高温堆肥过程中蔗糖酶活性的变化[J]. 农业环境科学学报，2009，28（7）：1535-1540.

[3]崔虎山，黄晓静，王山，等. 低温生产高活性右旋糖苷蔗糖酶的明串珠菌的筛选[J]. 食品科技，2011，36（12）：6-9.

[4]陈冰，林轩，梁诗莹，等. 蔗糖酶水解蔗糖的研究[J]. 湛江师范学院学报：自然科学版，1997，18（2）：57-60.

[5]陈维顺，于皆平，沈志祥，罗和生.蔗糖酶作为大肠腺瘤恶变倾向标志的研究[J]. 中国肿瘤临床，1996，23（8）：542-544.

[6]吴衍昌，范业鹏，孙秀玲，等. 口腔肿瘤恶变与唾液蔗糖酶活性的相关性研究[J]. 黑龙江医学，2000，7（7）：3-5.

[7]余瑞元，倪逸声，王林，等. 大鼠、小鼠胰蛋白酶的分离纯化及动力学性质[J]. 生物化学杂志，1993，9（6）：659-663.

[8]杨翠竹，李艳，阮南，等. 酵母细胞破壁技术研究与应用进展[J]. 食品科技，2006，31（7）：138-142.

[9]李宏君，尹际彤，杨启东. 细胞破碎方法简述[J]. 黑龙江医药，2002，15（2）：124.

[10]严娟，蔡志翔，张斌斌，等. 桃果肉总酚提取和测定方法的研究[J]. 江苏农业学报，2013，29（3）：642-647.

[11]蒋彦婕，吴纪中，张巧凤，等. 紫小麦麸皮花色苷提取工艺及其结构[J]. 江苏农业学报，2012，28（5）：1146-1151.

[12]郑学玲，李利民，姚惠源.小麦麸皮水溶性戊聚糖的分离及分级纯化[J]. 无锡轻工大学学报：食品与生物技术，2004，23（2）：1-4.

[13]Miller G L. Use of DinitrosaIicylic acid reagent invertase for determination of reducing sugar[J]. Analytical Chemistry，1959（31）：426-428.

[14]徐桦，陆珊华，孙爱民. 酵母蔗糖酶Km值的测定[J]. 南京医科大学学报：自然科学版，1999，19（4）：329-331.

[15]戴佳锟，李燕，马齐，等. 从毕赤酵母中提取外源重组蛋白的超声破碎条件及优化[J]. 食品科学，2012，33（10）：57-60.endprint

摘要：采用单因素试验和L9（33）正交试验确定酿酒酵母的最佳超声破碎条件。结果表明，酿酒酵母的最佳超声破碎条件为：破碎功率350 W、总工作时间25 min、工作时间/间歇时间15 s/25 s。

关键词：酵母细胞；蔗糖酶；酶活性；超声破碎法；正交试验

中图分类号： TS201.2+5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0237-03

收稿日期：2013-08-26

作者简介：李聪（1984—），女，辽宁抚顺人，硕士研究生，助理实验师，研究方向为食品微生物发酵。E-mail：lcfayewong@126.com。蔗糖酶（sucrase，EC 3.2.1.26）别称转化酶，能催化蔗糖水解产生葡萄糖、果糖，是一种广泛存在于自然界中的糖苷酶[1]。目前蔗糖酶已在农产品加工业[2]、食品工业[3-4]、医药行业[5-6]中发挥重要作用。工业上一般从酵母中提取蔗糖酶[7]。蔗糖酶属于胞内水解酶，提取时须对酵母细胞进行破壁处理，酵母细胞的破壁方法主要有机械研磨法、酶解法、反复冻融法等[8]，这些方法都有一些不足之处，例如酶解法耗时长、费用高，机械研磨法操作复杂、损耗大等[9]。超声波具有空化效应，会产生机械剪切压力而使细胞破碎[10-11]。本研究采用超声波法破碎酵母细胞，以期找出有效保存酵母蔗糖酶活性的超声破碎条件。

1材料与方法

1.1菌株

酿酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）GY 7，由辽宁石油化工大学化学化工与环境学部实验室保存。

1.2培养基

种子培养基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏 15 g/L，氯化钠4 g/L，pH值 7.0。

摇瓶发酵培养基：葡萄糖 20 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4 1 g/L，pH 值5.5。

1.3仪器设备

立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；全温振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技生物有限公司）。

1.4方法

1.4.1酿酒酵母的培养及收集向装有30 mL液体种子培养基的250 mL三角瓶中接种两环斜面种子，30 ℃、150 r/min 振荡培养24 h，得到二级种子液。将二级种子液以10%的接种量接入100 mL发酵培养基中，29 ℃、摇床转速160 r/min条件下培养27 h左右。取菌液于4 000 r/min离心10 min，得到酵母菌体细胞。

1.4.2超声破碎酿酒酵母将离心得到的菌体用pH值4.6的醋酸-醋酸钠缓冲液冲洗2次，取菌体1 g，加入到50 mL缓冲液中充分振荡混匀制成菌悬液，在超声细胞破碎仪中破碎，破碎条件按单因素试验和正交试验表进行。

1.4.3酵母蔗糖酶的提取 将超声破碎后细胞悬浊液于 12 000 r/min 离心20 min，得到上清即为粗酶液。向粗酶液中加入乙醇使其质量分数达30%，4 ℃放置过夜，12 000 r/min 离心15 min，取上清液，再追加投入乙醇使其终质量分数达50%。4 ℃放置1 h，12 000 r/min离心15 min，弃上清液，沉淀用双蒸水溶解，4 ℃保存[12]。

3结论与讨论

酿酒酵母细胞壁较厚，在超声破碎过程中超声功率的选择非常重要，功率较小影响酵母细胞破碎率，导致酵母蔗糖酶活力较低；而功率过大则会引起细胞悬液飞溅或产生泡沫。

超声破碎的工作时间/间歇时间对蔗糖酶活力有显著影响，当超声破碎时间大于间歇时间时，超声破碎过程中产生了较多热量，而较短的间歇时间使热量无法散发，从一定程度上破坏了蔗糖酶活性。因此设定工作时间/间歇时间时，应使超声时间短于间歇时间。

本研究以酵母蔗糖酶活力为指标，将超声破碎功率、总工作时间、工作时间/间歇时间列为考察因素，通过单因素试验及正交试验探寻超声破碎酵母细胞的最佳条件。试验优化后的超声破碎条件为超声功率350 W，总工作时间25 min，工作时间/间歇时间15 s/25 s。优化后的超声破碎酵母细胞法与酸碱裂解法、反复冻融法、酶解法相比，更为简便、快捷、经济、实用，适于实验室及小规模的破碎酵母提取蔗糖酶等胞内活性物质试验。

参考文献：

[1]郭小路，张万秋，阙瑞琦，等. 薄荷幼叶蔗糖酶的分离纯化与部分性质[J]. 西南大学学报：自然科学版，2008，30（2）：90-94.

[2]梁东丽，谷洁，高华，等. 不同禽畜粪便静态高温堆肥过程中蔗糖酶活性的变化[J]. 农业环境科学学报，2009，28（7）：1535-1540.

[3]崔虎山，黄晓静，王山，等. 低温生产高活性右旋糖苷蔗糖酶的明串珠菌的筛选[J]. 食品科技，2011，36（12）：6-9.

[4]陈冰，林轩，梁诗莹，等. 蔗糖酶水解蔗糖的研究[J]. 湛江师范学院学报：自然科学版，1997，18（2）：57-60.

[5]陈维顺，于皆平，沈志祥，罗和生.蔗糖酶作为大肠腺瘤恶变倾向标志的研究[J]. 中国肿瘤临床，1996，23（8）：542-544.

[6]吴衍昌，范业鹏，孙秀玲，等. 口腔肿瘤恶变与唾液蔗糖酶活性的相关性研究[J]. 黑龙江医学，2000，7（7）：3-5.

[7]余瑞元，倪逸声，王林，等. 大鼠、小鼠胰蛋白酶的分离纯化及动力学性质[J]. 生物化学杂志，1993，9（6）：659-663.

[8]杨翠竹，李艳，阮南，等. 酵母细胞破壁技术研究与应用进展[J]. 食品科技，2006，31（7）：138-142.

[9]李宏君，尹际彤，杨启东. 细胞破碎方法简述[J]. 黑龙江医药，2002，15（2）：124.

[10]严娟，蔡志翔，张斌斌，等. 桃果肉总酚提取和测定方法的研究[J]. 江苏农业学报，2013，29（3）：642-647.

[11]蒋彦婕，吴纪中，张巧凤，等. 紫小麦麸皮花色苷提取工艺及其结构[J]. 江苏农业学报，2012，28（5）：1146-1151.

[12]郑学玲，李利民，姚惠源.小麦麸皮水溶性戊聚糖的分离及分级纯化[J]. 无锡轻工大学学报：食品与生物技术，2004，23（2）：1-4.

[13]Miller G L. Use of DinitrosaIicylic acid reagent invertase for determination of reducing sugar[J]. Analytical Chemistry，1959（31）：426-428.

[14]徐桦，陆珊华，孙爱民. 酵母蔗糖酶Km值的测定[J]. 南京医科大学学报：自然科学版，1999，19（4）：329-331.

[15]戴佳锟，李燕，马齐，等. 从毕赤酵母中提取外源重组蛋白的超声破碎条件及优化[J]. 食品科学，2012，33（10）：57-60.endprint

摘要：采用单因素试验和L9（33）正交试验确定酿酒酵母的最佳超声破碎条件。结果表明，酿酒酵母的最佳超声破碎条件为：破碎功率350 W、总工作时间25 min、工作时间/间歇时间15 s/25 s。

关键词：酵母细胞；蔗糖酶；酶活性；超声破碎法；正交试验

中图分类号： TS201.2+5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0237-03

收稿日期：2013-08-26

作者简介：李聪（1984—），女，辽宁抚顺人，硕士研究生，助理实验师，研究方向为食品微生物发酵。E-mail：lcfayewong@126.com。蔗糖酶（sucrase，EC 3.2.1.26）别称转化酶，能催化蔗糖水解产生葡萄糖、果糖，是一种广泛存在于自然界中的糖苷酶[1]。目前蔗糖酶已在农产品加工业[2]、食品工业[3-4]、医药行业[5-6]中发挥重要作用。工业上一般从酵母中提取蔗糖酶[7]。蔗糖酶属于胞内水解酶，提取时须对酵母细胞进行破壁处理，酵母细胞的破壁方法主要有机械研磨法、酶解法、反复冻融法等[8]，这些方法都有一些不足之处，例如酶解法耗时长、费用高，机械研磨法操作复杂、损耗大等[9]。超声波具有空化效应，会产生机械剪切压力而使细胞破碎[10-11]。本研究采用超声波法破碎酵母细胞，以期找出有效保存酵母蔗糖酶活性的超声破碎条件。

1材料与方法

1.1菌株

酿酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）GY 7，由辽宁石油化工大学化学化工与环境学部实验室保存。

1.2培养基

种子培养基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏 15 g/L，氯化钠4 g/L，pH值 7.0。

摇瓶发酵培养基：葡萄糖 20 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4 1 g/L，pH 值5.5。

1.3仪器设备

立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；全温振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技生物有限公司）。

1.4方法

1.4.1酿酒酵母的培养及收集向装有30 mL液体种子培养基的250 mL三角瓶中接种两环斜面种子，30 ℃、150 r/min 振荡培养24 h，得到二级种子液。将二级种子液以10%的接种量接入100 mL发酵培养基中，29 ℃、摇床转速160 r/min条件下培养27 h左右。取菌液于4 000 r/min离心10 min，得到酵母菌体细胞。

1.4.2超声破碎酿酒酵母将离心得到的菌体用pH值4.6的醋酸-醋酸钠缓冲液冲洗2次，取菌体1 g，加入到50 mL缓冲液中充分振荡混匀制成菌悬液，在超声细胞破碎仪中破碎，破碎条件按单因素试验和正交试验表进行。

1.4.3酵母蔗糖酶的提取 将超声破碎后细胞悬浊液于 12 000 r/min 离心20 min，得到上清即为粗酶液。向粗酶液中加入乙醇使其质量分数达30%，4 ℃放置过夜，12 000 r/min 离心15 min，取上清液，再追加投入乙醇使其终质量分数达50%。4 ℃放置1 h，12 000 r/min离心15 min，弃上清液，沉淀用双蒸水溶解，4 ℃保存[12]。

3结论与讨论

酿酒酵母细胞壁较厚，在超声破碎过程中超声功率的选择非常重要，功率较小影响酵母细胞破碎率，导致酵母蔗糖酶活力较低；而功率过大则会引起细胞悬液飞溅或产生泡沫。

超声破碎的工作时间/间歇时间对蔗糖酶活力有显著影响，当超声破碎时间大于间歇时间时，超声破碎过程中产生了较多热量，而较短的间歇时间使热量无法散发，从一定程度上破坏了蔗糖酶活性。因此设定工作时间/间歇时间时，应使超声时间短于间歇时间。

本研究以酵母蔗糖酶活力为指标，将超声破碎功率、总工作时间、工作时间/间歇时间列为考察因素，通过单因素试验及正交试验探寻超声破碎酵母细胞的最佳条件。试验优化后的超声破碎条件为超声功率350 W，总工作时间25 min，工作时间/间歇时间15 s/25 s。优化后的超声破碎酵母细胞法与酸碱裂解法、反复冻融法、酶解法相比，更为简便、快捷、经济、实用，适于实验室及小规模的破碎酵母提取蔗糖酶等胞内活性物质试验。

参考文献：

[1]郭小路，张万秋，阙瑞琦，等. 薄荷幼叶蔗糖酶的分离纯化与部分性质[J]. 西南大学学报：自然科学版，2008，30（2）：90-94.

[2]梁东丽，谷洁，高华，等. 不同禽畜粪便静态高温堆肥过程中蔗糖酶活性的变化[J]. 农业环境科学学报，2009，28（7）：1535-1540.

[3]崔虎山，黄晓静，王山，等. 低温生产高活性右旋糖苷蔗糖酶的明串珠菌的筛选[J]. 食品科技，2011，36（12）：6-9.

[4]陈冰，林轩，梁诗莹，等. 蔗糖酶水解蔗糖的研究[J]. 湛江师范学院学报：自然科学版，1997，18（2）：57-60.

[5]陈维顺，于皆平，沈志祥，罗和生.蔗糖酶作为大肠腺瘤恶变倾向标志的研究[J]. 中国肿瘤临床，1996，23（8）：542-544.

[6]吴衍昌，范业鹏，孙秀玲，等. 口腔肿瘤恶变与唾液蔗糖酶活性的相关性研究[J]. 黑龙江医学，2000，7（7）：3-5.

[7]余瑞元，倪逸声，王林，等. 大鼠、小鼠胰蛋白酶的分离纯化及动力学性质[J]. 生物化学杂志，1993，9（6）：659-663.

[8]杨翠竹，李艳，阮南，等. 酵母细胞破壁技术研究与应用进展[J]. 食品科技，2006，31（7）：138-142.

[9]李宏君，尹际彤，杨启东. 细胞破碎方法简述[J]. 黑龙江医药，2002，15（2）：124.

[10]严娟，蔡志翔，张斌斌，等. 桃果肉总酚提取和测定方法的研究[J]. 江苏农业学报，2013，29（3）：642-647.

[11]蒋彦婕，吴纪中，张巧凤，等. 紫小麦麸皮花色苷提取工艺及其结构[J]. 江苏农业学报，2012，28（5）：1146-1151.

[12]郑学玲，李利民，姚惠源.小麦麸皮水溶性戊聚糖的分离及分级纯化[J]. 无锡轻工大学学报：食品与生物技术，2004，23（2）：1-4.

[13]Miller G L. Use of DinitrosaIicylic acid reagent invertase for determination of reducing sugar[J]. Analytical Chemistry，1959（31）：426-428.

[14]徐桦，陆珊华，孙爱民. 酵母蔗糖酶Km值的测定[J]. 南京医科大学学报：自然科学版，1999，19（4）：329-331.

[15]戴佳锟，李燕，马齐，等. 从毕赤酵母中提取外源重组蛋白的超声破碎条件及优化[J]. 食品科学，2012，33（10）：57-60.endprint