抗烟草花叶病毒活性放线菌的初步筛选和鉴定

曹毅等

摘要：为筛选对烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）具有拮抗活性的放线菌，以烤烟Coker 176、K326为材料，采用生物活性测试和半叶枯斑法，测定47株放线菌菌株发酵上清液抗TMV的活性，对具活性的菌株进行分子鉴定和系统发育分析。结果表明，6株放线菌的发酵上清液具有一定的抗TMV活性，其中菌株F187、F349、F417发酵上清液对TMV具有明显钝化作用，发酵上清液与TMV作用30 min后抑制率分别为57.18%、60.27%、70.19%；分子鉴定和系统发育分析显示菌株F187、F417、F349均属链霉菌；链霉菌F187、F349、F417的代谢产物对TMV有较高的抑制活性，值得在菌种鉴定、发酵条件优化、活性物质的分离与鉴定等方面进行深入研究。

关键词：烟草普通花叶病毒（TMV）；放线菌；抗病毒活性；分子鉴定

中图分类号： Q435.72 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0100-03

收稿日期：2013-11-12

基金项目：贵州省科学技术基金（编号：黔科合J字[2012]2257号、黔科合J字[2011]2336号）。

作者简介：曹毅（1982—），男，云南会泽人，硕士，助理研究员，从事微生物和植物保护研究。E-mail：yicao1001@163.com。烟草普通花叶病毒病（tobacco mosaic virus，TMV）严重威胁烟草的品质和产量，给烟草生产和烟草种植者造成了严重的经济损失。由于植物病毒对寄主细胞的绝对寄生性、植物缺乏完整的免疫系统以及病毒传播方式的多样性，目前尚无有效的防治措施和药剂。由烟草病毒病造成的经济损失已超过真菌引起的病害，成为烟草生产上威胁最大的一类病害[1]。长期以来，人们使用有机或无机化合物进行植株病毒病防治，不仅防效甚微[2]，也容易带来农药污染。安全可靠、环境友好的生物源农药成为病毒防治药剂的研究热点。与植物源、动物源农药相比，微生物源农药具有资源丰富、成本低、效果稳定和易商品化等特点[3-4]，是公认的无公害农药。近年来国内外大量研究表明，许多细菌[5]、真菌[6]和大型真菌[7]的代谢产物具有良好的抗植物病毒活性，为防治植物病毒病开辟了新的途径。

放线菌是一类极具经济价值和广泛应用前景的微生物资源，因其丰富的代谢产物，已被广泛应用于工业、农业和医学领域。放线菌来源的抗病毒活性物质如宁南霉素（ningnanmycin）、嘧肽霉素（cytosinpeptidemycin）、全霉素（holomycin）等对植物病毒病具有一定的治疗效果[5]。由于病毒侵染危害植物的作用机理复杂以及植物病毒学研究方法受到一些因素制约等原因，其研究开发还处于初级阶段，目前我国登记生产的微生物源抗植物病毒剂还很少。因此，不断挖掘有生物活性的放线菌资源，开发有自主知识产权、对环境友好且高效的抗病毒剂，具有重要的社会、生态和经济意义[8]。

本研究对前期从云南、贵州、河南等全国主要植烟区健康烟草根际土壤分离纯化的放线菌进行发酵产物抗病毒活性筛选，通过16S rDNA序列和系统发育分析对具有抗病毒活性的菌株进行分类地位的确定，以期为抗病毒放线菌资源的筛选和绿色农业的发展提供基础。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1放线菌菌株供试的47株放线菌均采集、分离自田间健康烟草根际土壤。

1.1.2烤烟品种TMV枯斑寄主烟草Coker 176、系统侵染寄主烟草K326，由贵州省烟草科学研究院良种繁育中心提供。

1.1.3供试毒源供试病毒为纯化的TMV，试验前繁殖保存于烟草K326。

1.1.4培养基高氏1号培养基：可溶性淀粉20 g、KH2PO4 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、KNO3 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、琼脂18 g，蒸馏水定容至1 L，121 ℃灭菌 20 min 后备用。

黄豆粉培养基：黄豆粉 25 g、酵母浸膏 5 g、NaCl 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨2 g、可溶性淀粉 10 g、CaCO3 0.5 g，蒸馏水定容至1 L，调节pH值至7.2，121 ℃ 灭菌 30 min。

1.1.5主要试剂16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit、DL2000 DNA Marker、Premix Ex Taq购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa），其他试剂均为国产分析纯。

1.2试验方法

1.2.1放线菌发酵产物的制备供试菌株接种于高氏1号培养基，28 ℃培养箱中活化培养4 d，用直径5 mm的打孔器打取菌株生长良好的菌饼，接种于装有100 mL高氏1号液体培养基的250 mL三角瓶中，每瓶6块；28 ℃、180 r/min振荡培养4 d后按5%的接种量接种于发酵培养基中，28 ℃、180 r/min 振荡培养7 d后，无菌条件下吸取发酵产物于灭菌离心管中8 000 r/min离心15 min，收集菌株发酵上清液，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2寄主培养和病毒接种供试烟草按常规育苗规程进行培育管理，7～8张叶时用于病毒接种。取新鲜感染TMV的病叶置于灭菌研钵中加适量金刚砂研磨匀浆，加入0.01 mol/L pH值7.2的磷酸缓冲液，离心后取上清液，配制40倍液的病毒汁液（40 mL/g病叶）。接种前喷洒适量金刚砂于叶片表面，用配置的病毒汁液进行常规摩擦接种，接种2 min后用清水喷雾冲洗叶面，于25 ℃无虫温室内进行。

1.2.3抗TMV活性菌株的筛选初筛：取长势一致的K326每2株分为1组，病毒汁液摩擦接种后，分别在接种后的第2、4、6 天喷洒20%的待测放线菌发酵上清液，设置阴性空白对照（病毒接种后喷洒20%的未接菌发酵培养液）、阳性发病对照（病毒接种后喷洒灭菌蒸馏水）。第10天开始观察记录发病情况，每组2株的心叶脉明、轻微花叶，或上部不超过 1/3 叶片花叶以及2株中只有1株出现1/3～1/2叶片花叶或少许变形或主侧脉坏死，植株矮化为正常株高的2/3以上的记录菌株号，保留备用。2株都出现1/2～2/3叶片花叶或变形或主侧脉坏死或全株叶片花叶或严重变形或坏死，病株明显矮化的则放弃。

复筛：将初筛保留的菌株发酵液与等量TMV病叶汁液混合，室温放置30 min后，以发酵培养基与病毒汁液混合为阳性对照，采用半叶枯斑法[9]接种4～5叶期的TMV枯斑寄主烤烟Coker 176，左半叶接种对照，右半叶接种经发酵液处理的TMV病叶汁液。每个处理4～5张叶，重复3次。接种5～7 d后记录枯斑数，计算病毒抑制率：

抑制率=（对照枯斑数-处理枯斑数）/对照枯斑数×100%。

1.2.4活性菌株的分子鉴定对具有抗TMV活性的菌株进行分子生物学鉴定，菌株基因组DNA的小量提取参照Li等的方法[10]进行。PCR引物为细菌16S rRNA序列通用引物（27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），参照16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit试剂盒说明书进行。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送交北京诺赛基因组中心有限公司进行测序。

1.2.5菌株系统发育分析通过NCBI网站上的BLAST程序将测定的序列与GenBank中的序列比较，从GenBank中获取和试验菌株相近种的16S rDNA序列，利用MEGA 5.1软件构建进化树[11]。

2结果与分析

2.1抗TMV放线菌的筛选

将前期分离保存的47株放线菌活化后进行摇瓶发酵，收集47份发酵正常、无杂菌污染发酵上清液分别进行初筛试验，结果表明：大部分放线菌发酵上清液无抗TMV作用，喷洒后的植株第10天逐渐表现叶脉间褪绿、叶片畸变、严重系统花叶至叶片坏死或矮化、或死亡，而其中6株放线菌发酵上清液处理植株未出现发病症状或仅表现较轻微的斑驳或系统花叶，具有一定的抗病毒TMV作用。将初筛的6株放线菌发酵上清液在Coker 176上进行半叶枯斑法复筛验证，枯斑抑制率的结果见表1。从表1可以看出，菌株F187、F349、F417发酵上清液对TMV具有明显钝化作用，发酵上清液与TMV作用30 min后，抑制率分别为57.18%、60.27%、70.19%，菌株F370、F350-2、F251的抑制作用相对较差。

3结论与讨论

由TMV导致的烟草花叶病毒是烟草生产中的一类主要病害[12]，其在病叶残体和土壤中可以存活数年，有很强的抗逆性。据调查，贵州移栽期烟苗的TMV平均带毒率可达202%[13]，可见其对贵州省烟草生产具有较大的潜在危害。从微生物资源中筛选抗植物病毒病物质已成为病毒病防治研究的热点，利用放线菌的抗病毒活性物制备新农药是未来无

公害农药的主要发展方向[13]。目前人们已发现链霉菌中多个种如诺尔斯链霉菌西昌变种（Strepcomces noursei var. xichangensis）、不吸水链霉菌辽宁变种（Streptomyces ahygroscopicus var. Liaoningensis）等放线菌产生的抗生素及非抗生素类物质对植物病毒病具有一定的治疗效果[14-15]。本研究中的放线菌均采集、分离自烟草根际土壤，烟草根际特有的环境可能使得菌株具有独特的代谢方式而产生具有特殊活性的代谢产物。本研究筛选的3株放线菌发酵上清液表现了明显的体外抗TMV活性，具有进一步研究和开发的价值。

本研究的主要目的在于筛选具有抗TMV活性的放线菌，笔者只对菌株发酵上清液的抗TMV活性进行了初步研究，其菌体是否具有活性还未研究；研究中采用了适合大多数放线菌的发酵培养基及发酵条件进行发酵，而培养基种类及成分、放线菌菌龄、接种量、摇培时间及转速等对发酵液活性都有一定影响，今后可对活性放线菌的发酵条件进行优化，对活性物质的种类开展深入研究，同时结合基因工程菌的手段和方法，进一步挖掘、探索其在抗植物病毒上的开发应用潜力。

致谢：云南农业大学李应萍同学参加了病毒接种和枯斑数统计工作，在此一并致谢。

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