褐飞虱唾液分泌物中细菌多样性的初步分析

唐明等

摘要：褐飞虱是我国水稻生产中的重要害虫，其唾液在取食过程中起着重要的作用。在笔者的前期研究中发现，褐飞虱在取食时会分泌凝胶状唾液和水溶性唾液。笔者收集了褐飞虱的水溶性唾液分泌物，通过建立16S ribosomal DNA（rDNA）文库检测了唾液分泌物中的微生物组成，共发现6种细菌，它们都属于变形菌门，其中属于γ变形菌亚门、β变形菌亚门的分别有4种、2种。此外研究还对褐飞虱取食后残留在水稻叶鞘中的口针鞘内部进行了透射电镜观察，发现在口针鞘内部和周围都有微生物的存在。研究结果可为进一步认识褐飞虱的取食行为以及褐飞虱体内的细菌型共生菌的生物学特性提供参考和依据。

关键词：褐飞虱；唾液分泌物；细菌多样性；细菌型共生菌

中图分类号： S435.112+.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0090-03

收稿日期：2013-08-17

基金项目：国家自然科学基金（编号：31201514）；贵州省科技基金（编号：黔科合J字[2012]2277号）；贵州省高层次人才科研条件特助经费项目（编号：TZJF-2011年-39号）；贵阳市社会发展与民生科技项目（编号：筑科合同[2012103]85号）。

作者简介：唐明（1979—），男，贵州遵义人，博士，讲师，主要从事植物保护研究。Tel：（0851）6702541；E-mail：tangming2006@hotmail.com。

通信作者：乙引，男，重庆合川人，博士，教授，主要植物生理生化研究。Tel：（0851）6702541；E-mail：yiyin@gznu.edu.cn。褐飞虱又名稻褐虱[Nilaparvata lugens（Stl）]，属同翅目（Homoptera）蝉亚目（Cicademorpha）飞虱科（Delphacidae）。褐飞虱是典型的刺吸式口器昆虫，通过口针取食水稻韧皮部维管束中的汁液，因此褐飞虱是水稻生产中的重要害虫，具有季节性、迁飞性、暴发性和猖獗性等特点，给我国水稻生产造成了严重损失[1]。研究表明，褐飞虱取食过程包括口针穿刺和吸取汁液2个阶段，其中穿刺过程在维管束外面的薄壁组织处进行，口针刺入维管束后，褐飞虱分泌胶状唾液并凝结形成口针鞘，由于口针每次刺入的方向不同，导致形成分叉状的口针鞘；当口针刺入维管束组织后，褐飞虱即停止口针穿刺和分泌胶状唾液，通过口针鞘吸取汁液，这一阶段褐飞虱分泌水溶性唾液，水溶性唾液具有很复杂的生物学功能，包括分泌降解植物细胞壁的酶、防止植物形成胼胝质而阻塞维管束等[2-4]。

研究者对口针鞘的形态学进行了详细的研究，观察到褐飞虱在分泌水溶性唾液的过程中，微生物通过褐飞虱口针鞘向水稻叶鞘内部进行传播[4]。研究者推测，褐飞虱在对水稻取食的过程中，其体内的微生物可能参与了取食过程并同时感染了水稻。昆虫体内的共生菌在昆虫的生长、生殖以及植物病害的传播等方面具有特殊的作用，是探讨生命起源与进化关系的理想模型[5]。褐飞虱体内的真菌型的类酵母共生菌（yeast-like symbiote，YLS）对褐飞虱宿主有着重要的生理功能[6]，褐飞虱若缺乏类酵母类共生菌，其若虫时期则明显延长，若虫成活率，雌成虫体重、生长速率、产卵量明显低于正常褐飞虱[7]。还有研究表明，褐飞虱田间种群的致害性与YLS的数量有关，水稻抗性品种对YLS的作用与褐飞虱种群对抗性品种的适应性有关[8]。此外研究还发现，褐飞虱体内也存在细菌型共生菌，研究者通过建立并分析褐飞虱细菌型共生菌的16S ribosomal DNA（rDNA）文库发现，3个生物型的褐飞虱（生物型1、2、3）体内有18种细菌型共生菌，这些共生菌在分类上属于4个门（Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria、Bacteroidetes），并且这18种共生菌的种类与生物型有一定的对应关系[9]。此外还有一些研究也报道了褐飞虱体内的细菌型共生菌[10-11]。但是关于褐飞虱细菌型共生菌的生物学功能，以及细菌型共生菌与褐飞虱取食过程分泌的细菌微生物之间的关系等问题还有待研究。

为了研究褐飞虱在取食过程中分泌了哪些微生物进入水稻，本试验使用透射电子显微镜观察褐飞虱取食后遗留在水稻叶鞘中的口针鞘；收集并浓缩了褐飞虱的唾液分泌物，以研究其中的细菌型微生物组成。研究将为进一步认识褐飞虱的取食行为及褐飞虱细菌型共生菌的生物学特性提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料

生物型1的褐飞虱于2007年采种于位于杭州市的中国水稻研究所，在武汉大学遗传研究所养虫室的Taichung Native 1（TN1）水稻上进行饲养繁殖，饲养条件为：平均温度 28 ℃，平均光照16 h/d。

将TN1水稻种子用0.15%氯化汞消毒20 min，用无菌水洗6次，每次1 min；然后在无菌滤纸上滤干后用1/2 MS培养基在试管中进行无菌苗的培养，每个试管接种1粒；待植株长到约3叶期（高10～15 cm）时，使用褐飞虱生物型1进行取食，每株无菌苗平均接约20头的4～5龄若虫，取食时间 24 h；去掉植株上面的褐飞虱若虫，将植株从培养基中拔出，去掉叶和根部，留下叶鞘组织作为透射电镜观察的样品，以未放虫取食的水稻叶鞘作为对照材料。

1.2褐飞虱唾液分泌物的收集

用2层拉伸的Parafilm（BEMIS）封住2侧开口的圆柱形塑料容器（直径约8 cm）的一侧，在2层膜中间的夹层中加入约5 mL预先用0.22 μm滤膜过滤的2.5%蔗糖溶液，在瓶内放入约200头饥饿的褐飞虱，容器的另一侧用纱网罩住，防止褐飞虱窒息和逃逸。然后将容器倒放，使褐飞虱停留在内侧的Parafilm膜上取食蔗糖溶液（取食过程中分泌水溶性唾液）。48h后用注射器收集蔗糖溶液，于-20 ℃保存。试验重复数次，收集的蔗糖溶液用MAXI Dry Lyo冻干机（Heto-Holten）浓缩，通过升华作用使混合物脱水。将浓缩物于 -20 ℃ 保存。

1.3唾液分泌物中细菌型微生物总DNA的提取

使用DNeasy blood & tissue kit（Qiagen）试剂盒提取褐飞虱唾液浓缩物中的细菌型微生物总DNA，参照使用说明书操作。

1.4细菌型微生物16S rRNA文库的建立和分析

将扩增产物回收纯化后连接于pTA2载体（TOYOBO）上；使用大肠杆菌TOP10感受态细胞进行转化，检测阳性克隆的插入片段，选择插入片段为1.5kb大小左右的克隆。以27F/1492R扩增产物为模板，使用4 bp的限制性内切酶HhaⅠ、RsaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ对27F/1 492R扩增产物进行限制性酶切，酶切体系为20 μL，酶切条件为37 ℃酶切3 h。然后使用2%的琼脂糖凝胶检测酶切带谱并分类，选择克隆并送至上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.5使用透射电镜观察褐飞虱取食点周围和口针鞘内部的菌群

2结果与分析

2.1褐飞虱唾液分泌物中细菌型微生物的分析

3结论与讨论

褐飞虱在对水稻进行取食时，与水稻之间的相互作用机制是非常复杂的，褐飞虱的唾液在取食过程中所起的作用也是重要的研究对象[15]。本研究收集了褐飞虱水溶性唾液分泌物，并对唾液分泌物中的微生物组成进行了分析，结果检测到6种细菌型微生物。研究还对褐飞虱取食后残留口针鞘中的细菌型微生物进行了电镜观察，检测到褐飞虱残留在叶鞘中的口针鞘内部与褐飞虱取食点附近均有微生物的存在。但是关于这些微生物的种类、与唾液分泌物中检测到的细菌型微生物的关系等问题还有待于进一步研究。

参考文献：

[1]程遐年，吴进才，马飞. 褐飞虱研究与防治[M]. 北京：中国农业出版社，2003：1-16.

[2]Sōgawa K. The rice brown planthopper：feeding physiology and host plant interactions[J]. Annual Review of Entomology，1982，27：49-73.

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[17]Kaga H，Mano H，Tanaka F，et al. Rice seeds as sources of endophytic bacteria[J]. Microbes and Environments，2009，24（2）：154-162.

1.3唾液分泌物中细菌型微生物总DNA的提取

使用DNeasy blood & tissue kit（Qiagen）试剂盒提取褐飞虱唾液浓缩物中的细菌型微生物总DNA，参照使用说明书操作。

1.4细菌型微生物16S rRNA文库的建立和分析

将扩增产物回收纯化后连接于pTA2载体（TOYOBO）上；使用大肠杆菌TOP10感受态细胞进行转化，检测阳性克隆的插入片段，选择插入片段为1.5kb大小左右的克隆。以27F/1492R扩增产物为模板，使用4 bp的限制性内切酶HhaⅠ、RsaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ对27F/1 492R扩增产物进行限制性酶切，酶切体系为20 μL，酶切条件为37 ℃酶切3 h。然后使用2%的琼脂糖凝胶检测酶切带谱并分类，选择克隆并送至上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.5使用透射电镜观察褐飞虱取食点周围和口针鞘内部的菌群

2结果与分析

2.1褐飞虱唾液分泌物中细菌型微生物的分析

3结论与讨论

褐飞虱在对水稻进行取食时，与水稻之间的相互作用机制是非常复杂的，褐飞虱的唾液在取食过程中所起的作用也是重要的研究对象[15]。本研究收集了褐飞虱水溶性唾液分泌物，并对唾液分泌物中的微生物组成进行了分析，结果检测到6种细菌型微生物。研究还对褐飞虱取食后残留口针鞘中的细菌型微生物进行了电镜观察，检测到褐飞虱残留在叶鞘中的口针鞘内部与褐飞虱取食点附近均有微生物的存在。但是关于这些微生物的种类、与唾液分泌物中检测到的细菌型微生物的关系等问题还有待于进一步研究。

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1.3唾液分泌物中细菌型微生物总DNA的提取

使用DNeasy blood & tissue kit（Qiagen）试剂盒提取褐飞虱唾液浓缩物中的细菌型微生物总DNA，参照使用说明书操作。

1.4细菌型微生物16S rRNA文库的建立和分析

将扩增产物回收纯化后连接于pTA2载体（TOYOBO）上；使用大肠杆菌TOP10感受态细胞进行转化，检测阳性克隆的插入片段，选择插入片段为1.5kb大小左右的克隆。以27F/1492R扩增产物为模板，使用4 bp的限制性内切酶HhaⅠ、RsaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ对27F/1 492R扩增产物进行限制性酶切，酶切体系为20 μL，酶切条件为37 ℃酶切3 h。然后使用2%的琼脂糖凝胶检测酶切带谱并分类，选择克隆并送至上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.5使用透射电镜观察褐飞虱取食点周围和口针鞘内部的菌群

2结果与分析

2.1褐飞虱唾液分泌物中细菌型微生物的分析

3结论与讨论

褐飞虱在对水稻进行取食时，与水稻之间的相互作用机制是非常复杂的，褐飞虱的唾液在取食过程中所起的作用也是重要的研究对象[15]。本研究收集了褐飞虱水溶性唾液分泌物，并对唾液分泌物中的微生物组成进行了分析，结果检测到6种细菌型微生物。研究还对褐飞虱取食后残留口针鞘中的细菌型微生物进行了电镜观察，检测到褐飞虱残留在叶鞘中的口针鞘内部与褐飞虱取食点附近均有微生物的存在。但是关于这些微生物的种类、与唾液分泌物中检测到的细菌型微生物的关系等问题还有待于进一步研究。

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[11]李香香，杨焊，王志伟，等. 褐飞虱肠道细菌多样性分析[J]. 江苏农业科学，2011，39（1）：126-129.

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