依达拉奉对吸入性肺损伤大鼠肺组织的保护作用

王正冠，刘一凡，李芮冰，徐舒敏，郭宇妮，王成彬，陈宜鸿

解放军总医院，北京 1008531医学保障部；2临床检验科

依达拉奉对吸入性肺损伤大鼠肺组织的保护作用

王正冠1，刘一凡2，李芮冰2，徐舒敏2，郭宇妮2，王成彬2，陈宜鸿1

解放军总医院，北京 1008531医学保障部；2临床检验科

目的探讨依达拉奉对黑火药烟雾所致吸入性肺损伤大鼠的保护作用。方法将24只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(C组)、吸入性肺损伤组(S组)和依达拉奉组(E组)，每组8只。除正常对照组外，其余各组大鼠使用自制发烟装置构建吸入性肺损伤模型。造模成功后依达拉奉组按9 mg/kg腹腔注射依达拉奉注射液；正常对照组、吸入性肺损伤组腹腔注射0.9%氯化钠注射液12 ml/kg。于第7天从大鼠腹主动脉取血，检测各组大鼠动脉血气；肺湿/干重比(lung wet-todry weight ratio，W/D)；留取各组大鼠腹主动脉血液样本，离心取血清，待检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)含量。留取肺组织，制备肺组织匀浆后测定髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。取部分右肺组织，经4%甲醛溶液固定后做病理苏木精-伊红(HE)染色切片，光镜观察。结果与S组相比，E组大鼠动脉中PaO2水平升高(P＜0.01)，大鼠血清中IL-6、TNF-α水平降低并降低肺组织中MPO活性及MDA含量(P＜0.01)。光镜下观察，E组肺组织较S组肺组织水肿减轻，炎性细胞浸润减少。结论依达拉奉可能通过抑制自由基的产生及减少部分炎性介质的产生和释放，减轻烟雾吸入性肺损伤大鼠体内炎性反应，对肺组织起到一定的保护作用。

依达拉奉；吸入性肺损伤；大鼠

在战争或军事演习等特殊环境中常使用大量火药，军事人员极易因长期暴露于此环境而引发急性呼吸道和肺损伤，如化学性肺水肿、吸入性肺炎等，严重者甚至发展为呼吸衰竭[1]。森林大火以及日常发生的民用设施火灾所致人员死亡中，约80%是由于吸入燃烧产生的有毒气体致死而非烧伤[2]。大量烟雾进入肺部后，可引起肺组织发生过度炎症反应，造成机体组织损伤，其中氧自由基、细胞因子等起重要作用[3]。吸入性损伤发生后，系统性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)及缺氧中毒等因素可导致其他脏器继发性损伤，最终导致多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction failure，MODF)发生[4]。依达拉奉是一种有效的氧自由基清除剂，具有抑制脂质过氧化的抗氧化能力，可以抑制脑细胞(血管内皮细胞和神经细胞)的过氧化作用，延迟神经细胞死亡，临床主要用于脑缺血以及脑缺血引起的脑水肿和组织损伤[5]。急性肺损伤时自由基、细胞因子等炎性介质的大量产生是加重肺组织损伤的重要因素，自由基清除剂可能对烟雾引起的急性肺损伤有治疗作用。本研究拟探讨依达拉奉对烟雾所致急性肺损伤的治疗作用及其机制。

材料和方法

1 实验动物 健康成年雄性Wistar大鼠24只，体质量200 ～ 220 g，由本院实验动物中心提供，合格证号SCXK(京)2012-0001。大鼠于清洁房中饲养，温度21 ～ 24℃，湿度50% ～ 60%。

2 主要药物及试剂 依达拉奉(规格：5 ml，10 mg，南京先声东元制药有限公司，批准文号：国药准字H20031342)，硝酸钾、碳粉、硫磺粉(纯度99.9%，200目，北京西四化工原料公司)，大鼠IL-6ELISA试剂盒、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) ELISA试剂盒(美国R&D公司)，大鼠髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)试剂盒、大鼠丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(南京建成公司)，微量加样器(Eooendorf)，光学显微镜(OLYMPUS)，酶标仪(美国AWARENESS)

3 实验分组及动物模型制备 将24只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(C组)、吸入性肺损伤组(S组)和依达拉奉组(E组)，每组8只。空白对照组大鼠暴露于动物烟熏箱的空气中8 min，依达拉奉组、烟熏组置于动物烟熏箱中，并在10 g火药产生的烟雾中暴露8 min，制作黑火药烟雾吸入性肺损伤的大鼠模型。依达拉奉组大鼠暴露后按9 mg/kg腹腔注射依达拉奉注射液；正常对照组，吸入性肺损伤组腹腔注射0.9%氯化钠注射液12 ml/kg。所有大鼠均于暴露后第7天处死。

4 动脉血气分析 麻醉大鼠并取腹主动脉血1 ml，于30 min内采用罗氏Cobasb血气分析仪进行动脉血气分析。

5 计算肺湿/干重比(lung wet-to-dry weight ratio，W/D)值 处死大鼠后取右肺前叶及中叶，拭干表面血液后称湿重并记录，然后放入60℃烘箱烘烤48 h至恒重并记录干重，计算W/D值。

6 肺组织MPO活性及肺组织MDA含量测定 取肺组织100 mg，置于液氮中研磨后以1∶9比例加入0.9氯化钠注射液，制成10%的肺组织匀浆，采用MPO及MDA试剂盒，按照试剂盒说明书测定肺组织MPO活性及MDA含量。

7 血清IL-6、TNF-α含量 大鼠麻醉后腹主动脉取血，3 000 r/min离心15 min后取上清液，用ELISA方法按照说明书测定大鼠血清中IL-6、TNF-α含量。

8 肺组织病理学检查 观察肺组织大体病理改变，取右肺后叶浸入4%中性缓冲甲醛溶液中固定24 h，石蜡包埋，4 μm连续切片，常规HE染色后光镜下观察。

9 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计分析。符合正态分布及方差齐性的计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，与对照组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 动脉血气分析 与C组比较，S组PaO2明显降低，PaCO2明显升高(P＜0.01)。给予依达拉奉处理后，E组较S组PaO2升高(P＜0.05)且与C组无统计学差异(P＜0.05)，E组较S组PaCO2降低但无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2 肺W/D值 S组W/D值显著高于C组(P＜0.01)，E组W/D值显著低于S组(P＜0.01)。见表1。

3 大鼠肺组织MPO活性、MDA含量比较 S组MPO、MDA值显著高于C组(P＜0.01)，E组MPO、MDA值显著低于S组(P＜0.01)。S组与C组相比无统计学差异(P＞0.01)。见表1。

表1 各组大鼠PaO2、PaCO2、W/D值，肺组织MPO活性、肺组织MDA含量及血清TNF-α、IL-6水平Tab. 1 PaO2, PaCO2and W/D value, MPO activity and MDA content in lung tissue and levels of TNF-α and IL-6 in serum (±s，n=8)

表1 各组大鼠PaO2、PaCO2、W/D值，肺组织MPO活性、肺组织MDA含量及血清TNF-α、IL-6水平Tab. 1 PaO2, PaCO2and W/D value, MPO activity and MDA content in lung tissue and levels of TNF-α and IL-6 in serum (±s，n=8)

aP＜0.05, vs group C;bP＜0.05, vs group S;cP＜0.01, vs group C;dP＜0.01, vs group S

Group (n=8)PaO2(mmHG)PaCO2(mmHG)W/DMPO (U/g)MDA (nmol/mg prot)IL-6 (pg/ml)TNF-α(pg/ml) C87.37±3.6943.82±2.574.23±0.080.81±0.081.23±0.1523.21±1.6820.60±2.60 S59.60±9.86ac58.25±3.87ac5.95±0.46ac1.66±0.20ac2.16±0.21ac55.18±6.78ac61.88±4.91acE79.02±9.57abd53.92±8.22ac4.63±0.62abd0.91±0.12bd1.46±0.35bd34.86±4.18abcd27.24±3.32abd

4 大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较 S组TNF-α、IL-6水平显著高于C组(P＜0.01)，E组TNF-α、IL-6水平显著低于S组(P＜0.01)。E组IL-6水平较C组显著升高(P＜0.01)，E组TNF-α水平较C组显著升高(P＜0.05)。见表1。

5 病理学表现 活体解剖大鼠后观察大鼠肺组织颜色、柔软度及弹性。C组颜色呈微粉红色，质地柔软，弹性佳。在光镜下观察肺组织病理切片，可见C组大鼠肺泡结构清晰完整，肺泡间隔一致，无炎细胞浸润(图1A)。S组整体呈微黑色，且有少量出血斑块，肺泡腔增大，肺泡间隔增厚，可见炎细胞浸润，弹性较差(图1B)。E组大鼠肺呈肉红色，弹性尚可。病理切片显示肺泡间质炎性浸润均较S组明显减轻，肺泡腔未见渗出(图1C)。

讨 论

当人体吸入热力物质、有毒气体或刺激性物质后，会引起吸入性肺损伤，导致单核巨噬细胞及中性粒细胞等的活化和积聚，释放髓过氧化物酶、氧自由基及多种炎性细胞因子等。同时会导致肺部微血管被中性粒细胞和血管内皮细胞黏附从而阻塞，加重局部组织缺血缺氧，使得血管内皮通透性增加，进一步加速肺组织水肿的发生，加重肺部炎症反应[6-7]。目前，初步使用的急性肺损伤治疗药物有血管舒张剂的吸入治疗(一氧化氮吸入、前列环素吸入等)、肾上腺糖皮质激素、非甾体类抗炎药物、酮康哇等，但总体疗效不甚满意。因此，迄今尚无安全有效的早期药物干预和遏制疾病进展的强力治疗手段。依达拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)是强效的自由基清除剂，可通过电子转移作用清除自由基[8]。可减轻中性粒细胞浸润及细胞膜脂质过氧化连锁反应，抑制脂质自由基生成，促炎细胞因子表达下调[9-10]。张中军等[11]用依达拉奉治疗烧伤休克肺损伤大鼠，用药后6 h血浆MDA明显降低，SOD、GSH、GSHPX明显升高，与模型组比较有统计学差异。Fang等[12]的研究发现对重度烧伤大鼠给予依达拉奉可以改善严重烧伤引起的肺水肿和氧合减低。

本实验使用实验室自制黑火药发烟装置建立大鼠吸入性肺损伤模型，使用依达拉奉进行干预[13]。血气结果表明，依达拉奉可显著改善吸入性肺损伤大鼠的PaO2(P＜0.01)，使之恢复正常水平，同时降低了PaCO2水平，但无统计学差异(P＞0.05)。肺组织W/D值可衡量肺部发生炎症后水肿情况。本研究结果显示，与S组比较，E组可有效降低W/D值(P＜0.01)。MPO活性可间接反映组织中性粒细胞浸润的严重程度[14]。本实验结果显示，依达拉奉能显著降低吸入性肺损伤大鼠的MPO活性(P＜0.01)，且与正常组无统计学差异(P＞0.05)。提示依达拉奉能有效抑制中性粒细胞的渗出及MPO的释放，减轻肺组织的损伤。MDA是脂质过氧化反应的最终产物，其含量可反映组织中自由基的多少及脂质过氧化程度[15]。S组MDA含量增加表明吸入黑火药烟雾可破坏肺组织细胞膜结构，依达拉奉可降低MDA含量(P＜0.01)且与正常组无统计学差异(P＞0.05)，表明依达拉奉具有抗氧化作用。

烟雾吸入性损伤使肺泡巨噬细胞过度刺激，产生大量氧自由基、IL-6、TNF-α等，使肺毛细血管通透性增加，导致肺水肿程度加重[16]。TNF-α等多种炎性介质以及细胞因子，致使血管通透性增高，导致肺水肿形成，气道阻塞[17]。血浆中IL-6在炎性疾病中被视为预示多脏器功能衰竭及死亡的重要标志[18]。本实验通过血清TNF-α和IL-6水平间接反映肺组织炎性损伤的程度。根据本实验结果，烟雾吸入性损伤后，血清中TNF-α和IL-6水平均升高，依达拉奉能有效降低由烟雾吸入性损伤引起的促炎因子IL-6、TNF-α水平(P＜0.01)。

图 1 大鼠肺组织HE染色组织学观察(HE×100) A： 正常组； B： 烟熏组； C：依达拉奉组Fig. 1 Histology of HE-stained lung tissue (HE×100) A: normal group; B: smoke group; C: edaravone group

综上所述，由于依达拉奉能够减轻氧自由基或活性氧的破坏作用，所以依达拉奉对吸入性肺损伤的肺组织也应有保护作用[19]。本研究结果显示，依达拉奉可通过调节炎性因子的平衡及抗氧化对黑火药烟雾所致大鼠肺损伤发挥保护作用。

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Protective effect of Edaravone on inhalation lung injury caused by black gunpowder smoke in rats

WANG Zheng-guan, LIU Yi-fan, LI Rui-bing, XU Shu-min, GUO Yu-ni, WANG Cheng-bin, CHEN Yi-hong
1Department of Medical Security;2Department of Clinical Laboratory Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

WANG Cheng-bin. Email: wangcb301@126.com; CHEN Yi-hong. Email: 9578CYH@sina.com

ObjectiveTo explore the protective effect of Edaravone on inhalation lung injury caused by black gunpowder smoke in rats.MethodsTwenty four male Wistar rats were randomly divided into three groups (n=8): normal control group (C), inhalation lung injury group (S), Edaravone group (E). The rat model of inhalation lung injury was reproduced by a self-made smoke generator. Rats in E group were given 9 mg/kg of Edaravone by intraperitoneal injection. And at the same time the control group (C) and inhalation group (S) were injected normal saline (12 ml/kg). The animals were sacrificed seven days later, and the arterial blood gas values, lung wet-to-dry weight ratio (W/D) were tested. The blood samples were centrifugalized and the content of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) in serum were determined. The content of myeloperoxidase (MPO) activity and malondialdehyde (MDA) in lung tissue were detected. And the right lung tissue which was fixed by 4% of formaldehyde solution was observed by HE.ResultsThe level of PaO2in group E were higher than in group S (P＜0.01), however, TNF-α, IL-6 in serum, MPO activity in lung tissue and MDA content in group E were lower than in group S (P＜0.01). Histopathological observation showed less inflammatory exudates and infiltrations in group E than in group S.ConclusionEdaravone shows a protective effect on inhalation lung injury caused by black gunpowder smoke in rats by inhibiting the production of free radical and the release of inflammatory mediators.

edaravone; inhalation lung injury; rats

R 563.9

A

2095-5227(2014)11-1151-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.11.0191222221

时间：2014-07-15 14:45 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140715.1445.008.html

2014-05-11

全军“十二五”医学科研基金面上项目(CWS12J021)

Supported by the "12th Five-Year" Medical Science Research Foundation of PLA(CWS12J021)

王正冠，男，在读硕士。研究方向：战时烟雾吸入致肺损伤的炎症反应机制及预防治疗措施。Email: 672354871@qq.com

王成彬，男，博士，教授，主任医师，博士生导师。Email: wangcb301@126.com；陈宜鸿，男，博士，主任药师，硕士生导师。Email: 9578CYH@sina.com