MALDI—TOF—MS技术在血液系统疾病中的应用进展

张青宜

doi：10.3969/j.issn.1007-614x.2014.11.1

摘 要 蛋白质是人类执行生命活动的直接载体，对于蛋白质的深入研究，不但有助于全面阐释生命活动的本质，而且对于研究疾病发生机制、提前预警以及诊断疾病、疗效的预后预测均具有重要意义。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术是目前蛋白质组学研究中经常用到的质谱研究技术之一，已经广泛应用于临床研究。现就其在血液系统疾病中的应用进展进行总结。

关键词 MALDI-TOF-MS 血液系统疾病 应用进展

Application progress of MALDI-TOF-MS technology in the blood system diseases

Zhang Qingyi

Department of Hematology，the People's Liberation Army General Hospital（Beijing） 100853

Abstract Protein is the direct carrier of human life activities.For depth research on protein，it not only helps to explain the essence of life activity，but also have important significance on the study of the mechanism of diseases，early warning，diagnosis of the disease and the prediction of curative effect.At present，matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry（MALDI-TOF-MS） technology is one of the frequently used mass spectrometry techniques in proteomics research.It has been widely used in clinical research.We summarize the application progress of it in the blood system diseases.

Key words MALDI-TOF-MS；Blood system diseases；Application progress

对于蛋白质的深入研究，不但有助于全面阐释生命活动的本质，而且对于研究疾病发生机制、提前预警以及诊断疾病、疗效、预后预测均具有重要意义[1]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术是目前蛋白质组学研究中经常用到的质谱研究技术之一，从中可以寻找疾病相关的生物标志物[2]。近年来已有多位学者将其应用于血液系统疾病的诊断及监测中，现就其在血液系统疾病中的应用进展进行总结。

MALDI-TOF-MS技术

技术组成：主要有三部分构成：①基质：主要作用是在吸收激光能量同时使待测的样品分子转化成离子，即样品分子的离子化。②基质辅助激光解吸电离离子源（MALDI）：MALDI的作用原理是样品与基质形成的共结晶薄膜受到激光照射后，基质吸收激光能量并将其传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，从而使生物分子电离。③飞行时间质量分析器（TOF）：TOF的作用原理是气化状态下的离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间。

基本原理：将磁珠分选后的含有微量蛋白质的样本分散在过量的小分子基质中，将混合液体点到样品靶上，静置风干后放入离子源内；当靶点受到激光照射时，基质吸收激光的能量跃迁到激发状态，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离和气化，在高电压场内，将电离的样品分子从离子源转送到质量分析器内，根据到达检测器的飞行时间不同（即通过离子的质量电荷之比（M/Z）与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量），经离子检测器及计算机数据处理得到肽质量指纹图谱。由于每种蛋白质都有不同的氨基酸序列（一级结构），蛋白质酶解产生的肽片断序列也不全相同，其肽混合物质量数具有特征性。比较质谱分析中所得的肽质量指纹谱与多肽蛋白数据库中蛋白质的理论肽段，就可以对所测蛋白质进行鉴定。

MALDI-TOF-MS在血液系统疾病中的应用

急性白血病：急性白血病是严重威胁人类健康的恶性血液系统疾病之一，目前发病率有逐年增高趋势。早发现、早诊断可以进行早期干预疾病进程，对于改善患者预后具有重要意义。目前已经有多位学者将MALDI-TOF-MS技术应用于急性白血病的诊断。郑瑞玑等[3]应用MALDI-TOF-MS技术研究了51例急性白血病患者和10名健康志愿者的外周血血清蛋白质谱的表达情况，发现急性白血病患者外周血血清中存在多种蛋白质的差异表达，其中血清外源性凝集素的表达差异可作为初诊急性白血病诊断标志或者预后指标。田帅等[4]应用蛋白质组技术研究了急性髓系白血病（AML-M2a）患者诱导治疗前与复发者首次持续完全缓解时间具有明显差异的白血病细胞蛋白质的表达情况，质谱鉴定了6个差异蛋白质，分别为微管蛋白特定分子伴侣B、髓过氧化物酶、转胶蛋白2CH结构域、谷胱苷肽S-转移酶、锌酯蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶，经统计学分析发现它们的表达水平与患者预后相关。崔久嵬等[5]同时利用MALDI-TOF-MS技术研究了急性非淋巴细胞白血病（ANLL）与急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞差异蛋白质组表达情况，差异表达蛋白中髓系相关蛋白8和14不仅可以作为区别ANLL和ALL的分子标志，还可以区分ANLL细胞的分化阶段；Op18、热休克蛋白27等还可以作为新的分子标志区分ANLL和ALL。

MALDI-TOF-MS技术不仅应用于急性白血病的分类诊断，也可用于判断疾病疗效、微小残留病变检测、鉴别白血病细胞的耐药性。梁婷婷[6]等采用基于磁珠分离的MALDI-TOF-MS技术研究了30例初发急性白血病及其治疗缓解后血清标本，并获得血清多肽谱图，共得到具有统计学意义（P<0.05）的差异峰27个，其中治疗缓解后表达上调峰及下调峰分别为10个和17个，利用上述差异峰建立的诊断模型获得了100%敏感性和90%的特异性，认为该项技术可用于急性白血病疗效评价和发病机制研究。宋伟等[7]利用血清多肽图谱技术筛查出质荷比（m/z）为4468的多肽在初治AL患者中表达明显增高，而良性血液病患者中未见此现象，认为其可以用于AL患者MRD的检测、个体化治疗及预测复发。

多发性骨髓瘤：多发性骨髓瘤（MM）是一种起源于B淋巴细胞的浆细胞恶性肿瘤，其诊断目前需依靠临床表现、实验室检查、影像学等协同判断，基于单一实验室的实验结果较难作出诊断。目前已有多位学者将MALDI-TOF-MS技术应用于多发性骨髓瘤临床研究中，He A应用MALDI-TOF-MS技术研究了48个MM患者及74个健康人的血清样本，鉴定出的4个具有高分离特征的谱峰组成神经网络诊断模型，验证阶段的敏感性86.36%及特异性87.5%[8]。房亚哲等[9]通过对多发性骨髓瘤患者的骨髓上清液、血清及尿液研究后，成功筛查出与MM相关的多种差异表达蛋白，为进一步研究MM发生发展机制，完善MM诊断、鉴别诊断提供了参考依据。难治复发的多发性骨髓瘤患者大多与多药耐药现象相关，如何提前预知肿瘤细胞耐药并适时调整用药方案是当前临床遇见的难题。王剑利等[10]利用MALDI-TOF-MS技术对比分析临床上难治复发与治疗敏感的多发性骨髓瘤（MM）患者血清蛋白质组的差异，共得到59个有明显差异的多肽峰，将其中的10个质谱峰建成诊断遗传算法模型，其验证的灵敏度及特异性均100%，认为该方法可用于研究多发性骨髓瘤的耐药机制和临床预后判定。

骨髓增生异常综合征：骨髓增生异常综合征（MDS）是以骨髓无效造血及高危转化为急性白血病为临床表现的一组异质性克隆性疾病，临床表现与部分巨幼细胞性贫血、再生障碍性贫血、溶血性贫血相似，诊断主要依靠细胞形态学及遗传学相结合，尚未发现特异性的生物标志物。钟立业等[11]利用MALDI-TOF-MS技术研究了16例MDS患者及10例正常人的血清蛋白标本，利用12个有差异的蛋白峰建立起一个MDS诊断模型，其识别准确率和交叉验证敏感性分别达93.27%和89.94%，可以区分MDS与正常人，有助于MDS的临床辅助诊断。钟立业等还研究了RAEB型MDS、急性髓性白血病（AML）和正常人的血清蛋白标本各10例，通过MALDI-TOF-MS测定标本的蛋白质谱图，对比分析差异蛋白峰，并构建诊断模型，验证结果显示模型的MDS识别准确率达100%，敏感性达89.42%，认为利用MALDI-TOF-MS技术能够有效地区分RAEB患者、AML患者和正常人。根据血清差异蛋白质的组合峰所构建的诊断模型可辅助RAEB型MDS的诊断[12]。

镰状细胞贫血：MALDI-TOF-MS技术不仅在恶性血液系统疾病诊断、预后判断发挥作用，在其他血液系统疾病中也有深入研究应用。镰状细胞贫血（SCDs）属于遗传性血红蛋白病之一，新生儿血红蛋白病的筛查通常是利用敏感的电泳和等电聚焦电泳技术来确定异常的血红蛋白。目前该类疾病的常规新生儿筛查受科技及经济局限在多数国家并未执行，经常优选的方法是种族靶向新生儿筛查，不利于大面积扩展。Hachani J等[13]应用MALDI-TOF-MS技术对844例Guthrie卡上的新生儿干燥血凝块样本进行了回顾性研究，并从每1例干血斑样本中检测的1000个质谱中选取4个差异蛋白进行鉴定，结果以MALDI-TOF-MS为基础的筛查方法与传统方法相比结果具有高度相关性，支持MALDI-MS技术可作为通用的筛查方法对SCDs新生儿进行筛查，具有高通量、经济、高敏感性及能够自动区分镰状血红蛋白等特点。

讨 论

2001年开始的蛋白质组学研究开创了后基因组研究的新时代。血液蛋白质组学研究是当前蛋白质组学研究重点领域之一。以MALDI-TOF-MS技术为主要手段的蛋白质组学技术已经越来越多地应用于血液系统疾病的研究中，其具有准确性高、稳定性好、灵敏度高、重复性好、高通量等特点，不但可以用于恶性血液病的诊断、发病机制、疗效及预后判断方面的研究，在良恶性血液疾病鉴别诊断方面也将发挥重大作用。未来随着新的质谱仪的出现，蛋白质谱技术在蛋白质组学研究中必将发挥越来越大的作用。

参考文献

1 杨泽松，陈建斌.蛋白质组学在白血病中的研究进展[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11（7）：1365-1368.

2 姚东，陈文虎，郑智国，等.WCX纳米磁珠联合MALDI-TOF-MS研究正常人血清蛋白指纹图谱的年龄与性别差异[J].肿瘤学杂志，2010，16（8）：644-647.

3 郑瑞玑，马旭东.急性白血病血清蛋白质谱特征研究[J].中华血液学杂志，2013，34（5）：426-429.

4 田帅，孟凡义，唐加明，等.急性髓系白血病M2a骨髓细胞蛋白质组学分析及其预后意义[J].中华医学杂志，2007，87（8）：538-541.

5 崔久嵬，王冠军，李薇，等.急性非淋巴细胞白血病与急性淋巴细胞白血病细胞差异蛋白质组分析[J].中国实验诊断学，2005，9（4）：498-501.

6 梁婷婷，王娜，王冠军，等.基于磁珠分离的生物质谱技术用于急性白血病疗效评价[J].分析化学，2010，38（2）：233-236.

7 宋伟，李薇，王冠军，等.利用血清多肽图谱技术筛查急性白血病微小残留病检测的标志物[J].中华血液学杂志，2013，34（8）：714-718.

8 He A，Bai J，Huang C，et al.Detection of serum tumor markers in multiple myeloma using the CLINPROT system[J].International journal of hematology，2012，95：668-674.

9 房亚哲，刘津，吴琳，等.应用尿液蛋白质组技术筛选多发性骨髓瘤相关蛋白的初步研究[J].中国实验诊断学，2011，15（4）：647-650.

10 王剑利，白菊，何爱丽，等.利用血清蛋白质组差异分析多发性骨髓瘤的耐药机制[J].西安交通大学学报（医学版），2012，33（3）：340-343.

11 钟立业，刘天浩，李扬秋，等.骨髓增生异常综合征患者血清蛋白质组学特征研究[J].实用医学杂志，2009，25（21）：3586-3588.

12 钟立业，刘天浩，耿素霞，等.利用MALDI-TOF-MS分析RAEB型骨髓增生异常综合征患者血清蛋白质组学特征[J].中华肿瘤防治杂志，2009，14（21）：1625-1628.

13 Hachani J，Duban-Deweer S，Pottiez G，et al.MALDI-TOF MS profiling as the first-tier screen for sickle cell disease in neonates：matching throughput to objectives[J].Proteomics Clinical applications，2011，5：405-414.