高效液相色谱法同时检测药渣中四环素及其衍生物

王敏等

摘要：建立了药渣中四环素及其衍生物残留的高效液相色谱检测方法。样品经pH 4.0的EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取后，用Agilent HC-C18色谱柱，以甲醇：乙腈（1∶2，V/V），含0.01 mol/L草酸为流动相，梯度洗脱，流速0.8 mL/min，检测波长300 nm。结果表明，方法检出限为0.05～0.10 mg/L，在0.1～100.0 mg/L范围内线性关系良好，加标回收率为85.8%～100.5%。该方法简便、快速、准确、选择性好，适用于药渣中四环素及其衍生物的定性定量分析。

关键词：高效液相色谱法；四环素及其衍生物；四环素药渣

中图分类号：Q815 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）06-1411-04

Simultaneous Determination of Tetracycline and Its Derivatives in Tetracycline Waste with HPLC

WANG Min1，2，MA Yu-long1，2，MA Lin1，2，WANG Yan1，2，SI Ji-tao1

（1.College of Chemistry and Chemical Engineering， Ningxia University， Yinchuan 750021，China；

2.Ningxia Engineering Research Center for Natural Medicine， Yinchuan 750021，China）

Abstract： A high performance liquid chromatographic method （HPLC） was developed to detect tetracycline and its derivatives in tetracycline waste. The samples were extracted with EDTA-Mcllvaine buffer group（pH 4.0）. Tetracycline and its derivatives were successfully separated on Agilent HC-C18 column using methanol-acetonitrile（1∶2， V/V） containing 0.01 mol/L oxalic acid as mobile phase at a flow rate of 0.8 mL/min and were detected at 300 nm. The results showed that the limit of detection was 0.05～0.10 mg/L. The linear range was from 0.1 mg/L to 100.0 mg/L. The recoveries were from 85.8% to 100.5%. It was simple， rapid， accurate and selective for detecting tetracycline and its from derivatives in tetracycline waste or feed.

Key words： HPLC； tetracycline and its derivatives； tetracycline waste

四环素抗菌谱广、价格低廉，广泛应用于动物疾病的治疗、预防[1]。但同时在四环素生产过程中会产生大量废弃药渣，药渣是生产四环素的过程中发酵醪液经过滤提取后剩余的滤渣，其主要成分包括菌丝体、剩余培养基、代谢产物及少量的四环素[2]。这些药渣中虽含有丰富的营养物质，但也有四环素残留，极大地限制了其资源利用。四环素不稳定，经光照易分解成其衍生物差向四环素或脱水四环素等。差向四环素及脱水四环素药效极低或没有，其毒副作用较大，已经被欧盟确定为四环素的残留标识物[3]。发酵过程产生的废弃药渣目前已成为造成环境中四环素及其衍生物增加、耐药菌泛滥的主要原因之一[4]，被列为危险固体废弃物，许多国家对经处理或再利用后药渣的排放均有严格的残留限制和规定。因此，建立一种准确快速的四环素及其衍生物残留检测方法，对于四环素药渣的再处理及环境保护具有重要意义。

目前，四环素检测主要有微生物法[5]、薄层色谱法[6]、免疫分析法[7]、高效液相色谱法[8-10]以及液质联用法[11，12]，但关于四环素及其衍生物同时检测报道甚少。本研究主要采用高效液相色谱法同时检测药渣中残留的四环素及其衍生物，为四环素药渣再利用及环境残留监控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

四环素药渣由某四环素生产企业提供。

盐酸四环素（Sigma公司，纯度98%）、差向四环素（对照品，中国药品检验所）、脱水四环素（对照品，中国药品检验所）；甲醇、乙腈均为色谱纯；其他试剂均为分析纯试剂；去离子水。

1.2 仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津）；H-1850型离心机（湖南湘仪）；UV-1750型紫外可见分光光度计（日本岛津）；0.22 μm型聚四氟乙烯微孔滤膜。

1.3 方法

1.3.1 试剂配制 称取10 mg四环素（TC）、差向四环素（ETC）、脱水四环素（ATC），加入少量的甲醇溶解，然后转移至25 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，4 ℃避光保存。准确移取各标准储备液，用棕色容量瓶配制各种浓度的混合标准溶液，0.22 μm滤膜过滤，4 ℃避光保存。

EDTA-Mcllvaine缓冲提取液：称取柠檬酸（含1个结晶水）12.9 g，Na2HPO4·2H2O 10.9 g，EDTA3.72 g，用去离子水溶解并定容至1 L，调节pH至4.00±0.05。

1.3.2 前处理方法 称取试样0.5 g（精确至0.000 1 g）于50 mL离心管中，用10 mL提取液溶解，超声10 min，6 000 r/min离心10 min后，取上清液，残渣再加入10 mL提取液超声处理，离心后合并上清液，用棕色容量瓶定容至100 mL，0.22 μm滤膜过滤，滤液4 ℃避光保存，待测。

1.3.3 分析方法 分别取四环素（TC）、差向四环素（ETC）以及脱水四环素（ATC）标准溶液在200～450 nm波长下扫描，获取特征波长，以最大吸收波长为检测波长。

本试验采用Agilent HC-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈-甲醇（2∶1，V/V）-草酸溶液（0.01 mol/L）为流动相，流速为0.8 mL/min，柱温为30 ℃时，考察有机相比例对四环素、差向四环素以及脱水四环素保留时间及峰型的影响。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

四环素（TC）、差向四环素（ETC）以及脱水四环素（ATC）标准溶液的紫外-可见光谱图见图1。由图1可知，TC在350 nm有最大吸收，ATC在300 nm和430 nm有最大吸收峰，ETC在375和295 nm吸收最大，即：在300 nm处ATC、TC、ETC均有较大吸收，故选择300 nm为检测波长。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 有机相体积配比的选择 以乙腈-甲醇（2∶1，V/V）-草酸溶液（0.01 mol/L）为流动相，考察了流动相中有机相体积配比（20%～35%，V/V）对TC及其衍生物保留时间及分离度的影响。由图2可知，随着有机相体积配比的增大，流动相的极性逐渐降低，各化合物的保留时间减少。当有机相比例为25%时，3种四环素均能得到分离，但脱水四环素的峰型不好且出峰时间较长，不利于其快速检测；当有机相比例增大到35%时，脱水四环素的峰型好且出峰时间缩短，但四环素、差向四环素保留时间接近，因此本试验采取梯度洗脱。图3，图4分别为该条件下标准品及样品的色谱图。

2.3 提取条件的优化

四环素类抗生素在醇类中的溶解度较大，在乙酸乙酯、乙腈、丙酮等溶剂中溶解度较小，易被色谱柱上残存的硅醇基吸附且易与金属离子形成螯合物[13，14]，而EDTA能够抑制四环素类抗生素与硅醇基的吸附及与金属离子的螯合，且超声可以促进药渣的溶解。因此，本研究分别选取甲醇和EDTA-Mcllvaine缓冲溶液作为提取剂，比较了超声和直接提取的效果，结果如图5所示。超声提取回收率均高于直接提取，甲醇提取的回收率高于EDTA-Mcllvaine缓冲液，但由于甲醇提取（图6）的杂质较多，不利于目标化合物的准确定量，因此试验采取EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取。

2.4 线性关系与检测限

分别移取适量3种四环素的标准储备液，配制成0.1、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0和100.0 mg/L系列浓度的混合标准品溶液，按上述确定的色谱条件分别进样20 μL。以3种四环素标准品的质量浓度X（mg/L）对峰面积Y线性拟合，3种组分线性方程见表1，以3倍信噪比求出检出限，以10倍信噪比求得定量限。由结果可知，峰面积与质量浓度范围在0.1～100.0 mg/L呈良好线性关系，检出限为0.05～0.10 mg/L，定量限为0.163～0.330 mg/L。

2.5 样品测定

称取四环素药渣0.5 g，平行5份，按上述提取方法及色谱条件测定药渣中3种四环素，并由标准曲线计算其含量，药渣样品中TC、ETC和ATC的平均含量分别为23.6、20.5、2.8 mg/L。

2.6 精密度和回收率

称取已知含量的四环素药渣0.5 g，分别添加低、中、高3个浓度水平的混合标准溶液，按上述提取方法及色谱条件进行回收率试验，每个添加浓度取5个平行样。回收率测定结果如表2所示。

3 结论

选用EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取四环素、差向四环素及脱水四环素，回收率为85.8%～100.5%。高效液相色谱分析时，用甲醇-乙腈-草酸溶液0.01 mol/L为流动相，采用梯度洗脱的方式，使四环素类抗生素可在20 min内分离。该方法简便、快速、灵敏度高、选择性好，适用于药渣中四环素及其衍生物的定性定量分析。

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